[发明专利]一种黑莓组培苗叶片高效循环再生的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用黑莓组培苗叶片反复循环再生的方法，属于植物组织培养技术领域。

技术背景

黑莓(Rubus spp.)为蔷薇科悬钩子属半灌木浆果类果树，果实为聚合果，营养丰富，富含糖、果酸及多种维生素，有防衰老和提高人体免疫力等功效，尤其是过氧化物歧化酶(SOD)含量为水果之最，是近年来国内外兴起的第三代水果之一，具有很高的经济价值。优良黑莓品种的培育和推广具有重要的应用和经济价值。目前，黑莓育种上多采用实生选优、杂交育种、辐射育种等常规育种手段为主，有一定的局限性，而且选育进程较慢，严重制约了黑莓优良品种的快速发展。

随着分子生物学的发展，基因工程技术为黑莓育种开辟了新途径。可以通过基因工程的方法，有针对性地引入特定基因，从而获得具有优良性状的转基因植株。而基因成功实现转化的关键在于拥有一个高效而稳定的不定芽离体再生体系。已有的黑莓组织培养的研究中，以茎尖、腋芽培养等快繁研究居多，但这些组织或器官多因取材时间或受农杆菌侵染的限制未能用于实践。叶片具有易于取材和培养操作的优势，而组培苗的叶片具有分生能力强、无菌不易污染等特点，有助于提高叶片的再生频率和遗传转化效率。目前黑莓离体再生研究已取得了较好成果，但都是单向的一轮再生方法，国内外尚未见到有通过瓶外一次性取材，而达到瓶内永久循环再生黑莓苗的报道。

发明内容

发明目的：本发明的目的是针对现有黑莓离体再生技术的不足，提供一种利用黑莓试管苗叶片进行植株离体再生的方法，一方面为黑莓基因工程育种提供技术支撑，一方面为规模化生产快速提供优质苗木。

本发明所述循环再生体系是指：通过组织培养的手段，由不同培养阶段的不定芽提供叶片，多重循环获得再生苗的植物组织培养体系。

具体内容：为实现上述目的，本发明采用的解决方案是：(1)瓶外获得黑莓茎段诱导产生初代试管苗；(2)黑莓试管苗叶片离体再生为完整植株；(3)愈伤组织分化所得不定芽叶片的离体循环再生；(4)继代增殖所得不定芽叶片的离体循环再生；(5)壮苗培养所得不定芽叶片的离体循环再生。

(1)瓶外获得黑莓茎段诱导产生初代试管苗的方法是：以黑莓一年生枝条的半木质化茎段为外植体，用浓洗衣液浸泡冲洗后，于体积比为(70～75)％的酒精中浸(30～60)s，用无菌水冲洗3～5次，再用(0.1～0.2)％升汞浸泡(5～8)min；然后将外植体切成(1.0～1.5)cm长的带芽茎段，接种于不定芽诱导培养基上，培养(20～40)d，进行不定芽的继代增殖，每隔(20～30)d继代1次，继代2次以上的试管芽苗作为叶片离体再生的材料。

所述的茎段诱导不定芽培养基为：MS+6-BA(0～0.5)mg/L+ZT(0.5～1.0)mg/L+蔗糖(25～30)g/L+琼脂5.6g/L，pH值5.8～6.2；

所述的不定芽继代增殖培养基为：MS+6-BA(0～0.2)mg/L+TDZ(0～0.1)mg/L+蔗糖(25～30)g/L+琼脂5.6g/L，pH值5.8～6.2；

所述的培养条件为：培养室温度(25±3)℃，光照度(1500～3000)lx，光照时间(12～14)h/d。

上述解决方案中，诱导茎段形成不定芽的最佳培养基为：MS+6-BA 0.3mg/L+ZT 0.5mg/L+蔗糖25g/L+琼脂5.6g/L，ZT浓度过高会使不定芽出现玻璃化，并且抑制不定芽的生长；不定芽继代增殖最佳培养基为：MS+TDZ0.05mg/L+蔗糖(25～30)g/L+琼脂5.6g/L。

(2)黑莓组培苗叶片离体再生为完整植株的方法包括以下步骤：

①组培苗及其叶片的选择：当组培苗长至3叶以上时，选择最长边×最宽边为0.5cm×0.5cm以上的叶片，去掉边缘，修剪成(0.4～0.8)cm×(0.4～0.8)cm大小的叶块；

②诱导叶片形成愈伤组织：将步骤①修剪好的叶片在接种时背面紧贴于培养基表面；愈伤组织诱导培养基为：MS+TDZ(0.1～1.0)mg/L+蔗糖(25～30)g/L+琼脂5.6g/L，pH值5.8～6.2；培养时先在温度(25±3)℃的条件下暗培养(10～15)d，当叶片边缘开始卷曲膨大产生少量愈伤颗粒时，转到光照度(1000～2000)lx、光照时间(12～14)h/d的条件下，培养(15～20)d后形成淡黄色、致密的愈伤组织；