[发明专利]一种利用膨胀床富集分离螺旋藻藻蓝蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明提供一种利用膨胀床技术从螺旋藻破壁液中富集分离藻蓝蛋白的简单、快捷的方法。属于生化分离工程技术领域。

背景技术

螺旋藻藻蓝蛋白存在于螺旋藻的藻胆体中。藻胆体是红藻和蓝藻所特有的一种超分子捕光色素复合体。藻蓝蛋白色泽呈明亮的蓝色，颜色鲜艳，是食品、高级眼影、唇膏的首选纯天然色素。藻蓝蛋白还可以调节和合成人体代谢所需要的多种重要酶，具有明显的抗氧化、抗炎症作用，调节人体免疫系统，增强免疫系统功能。高纯度的藻蓝蛋白带有很强的荧光，制成的纯天然荧光试剂，用于临床医学诊断，免疫化学及生物医学工程等研究领域。

在我国，每年的螺旋藻全国总产量已达到7000吨。螺旋藻产量的三分之一用于直接出口，其余螺旋藻多以藻粉、藻片和灌注胶囊的形式当作保健品使用。螺旋藻的规模化开发和利用处于初级加工阶段，还没有深加工产品。螺旋藻中藻蓝蛋白的提取还处于实验室研究阶段，没有适合于工业化生产的好的工艺方法。目前，市场上销售的高纯度的藻蓝蛋白商品都是从国外进口，价格昂贵，在应用上受到限制。

因此，开发简便、快速的螺旋藻藻蓝蛋白的提取过程，提高螺旋藻藻蓝蛋白产品纯度是目前螺旋藻藻蓝蛋白的规模化开发利用中亟待解决的关键问题。已报道的有关制备藻类藻蓝蛋白的专利技术，例如中国专利CN1106414A、CN1130028A、CN101003565A、CN00117512.2、CN100434528C等的共同特征为藻蓝蛋白提取都需经过藻体细胞破壁、离心或过滤去除细胞碎片和其它固体微粒、盐析或等电点粗提阶段，然后用离子交换树脂等层析方法提纯，过程繁琐，生产成本增加。

膨胀床可从含有细胞和细胞碎片的粗液中直接分离回收目标产物，无需离心、过滤等步骤。经对现有技术文献检索发现，目前尚未见有关膨胀床技术用于富集分离螺旋藻藻蓝蛋白的方法。将膨胀床技术应用于富集分离螺旋藻藻蓝蛋白过程，在很大程度上减少螺旋藻藻蓝蛋白分离纯化步骤，降低了纯化成本。

发明内容

本发明提供一种利用膨胀床富集分离螺旋藻藻蓝蛋白的方法，通过自制的JDN-8微球作为专用吸附载体，在膨胀床中直接富集分离螺旋藻破壁液的藻蓝蛋白，从而简化藻蓝蛋白的提取步骤，降低生产成本，提高生产效率，获得较高纯度的藻蓝蛋白，应用于天然色素、保健食品和新药的研究开发。

本发明所要解决的技术问题是提供一种从螺旋藻的破壁液直接富集分离藻蓝蛋白的膨胀床层析技术，无需先用离心、过滤等方法去除破壁液中的细胞碎片和其它杂质。其方法简单，快捷，运行成本低，所得的藻蓝蛋白具有较高的回收率、纯度，原料既可采用新鲜螺旋藻也可采用螺旋藻干粉，从而提供了一种解决螺旋藻藻蓝蛋白资源规模化利用的方法。

本发明的技术方案：一种利用膨胀床富集分离螺旋藻藻蓝蛋白的方法，步骤为：

(1)螺旋藻破壁液的制备；(2)JDN-8微球在膨胀床中富集蓝藻破壁液中的藻蓝蛋白；(3)用提取剂从膨胀床中洗出细胞碎片和其它杂质；(4)洗脱分离藻蓝蛋白；(5)洗脱液经冷冻干燥，最终获得一定纯度的藻蓝蛋白。

所述的方案，步骤1中，对于螺旋藻的细胞破壁，采用水或磷酸缓冲液作提取剂，磷酸缓冲液的浓度为25～100mmol/L，藻粉或鲜藻与提取液的固液比为1∶50～1∶150，搅拌均匀后，置于-10℃～-20℃下冷冻一定时间后，37℃溶解，如此反复冻融4-6次，融化后获得的破壁液。

所述的方案，步骤2中，在400mm×16mm玻璃柱内(液体分布器为200目丝网)加入10g的JDN-8微球，从柱底注入提取剂，使微球上浮膨胀稳定，微球膨胀床层的膨胀率为1.5-3.0，膨胀床层稳定时间20分钟后，在柱底将提取剂迅速切换为螺旋藻破壁液，破壁液蛋白质浓度为0.2～0.5mg/ml，当柱顶流出液的蛋白质浓度为柱底注入破壁液的蛋白质浓度的70～80％时，膨胀床中JDN-8微球的吸附量达到饱和，停止注入破壁液。

所述的方案，步骤3中，将步骤2中获得的饱和吸附蓝藻蛋白的JDN-8微球膨胀床的注入流体从破壁液迅速切换成提取液，微球床层的膨胀率与步骤2中相同，冲洗去除柱中的细胞碎片和其它杂质，直到柱顶流出液在550nm处的吸光度值A₅₅₀等于零。

所述的方案，步骤4中，将步骤3中所述膨胀床静置，使床中的JDN-8微球自然沉降，将多余的液体放出，使液面刚好与柱床表面一致。从柱顶注入pH值为7.0、浓度为500～1000mmol/L的磷酸缓冲液，流速为20～100ml/min，从JDN-8型微球上洗脱收集富含藻蓝蛋白的洗脱液段。