[发明专利]一种尼罗罗非鱼精子超低温保存的方法

权利要求书

1.一种尼罗罗非鱼精子超低温保存的方法，其步骤是：

(1)尼罗罗非鱼精子的采集：选择性腺发育成熟的尼罗罗非鱼雄鱼，用干毛巾擦干生殖孔周围及腹部的水，用手轻轻挤压雄鱼腹部，待能挤出精液后，前面3-6滴精液不要，然后将精液挤入干燥的容器中，混匀；

(2)精子活力检测：在10×20倍的显微镜下进行镜检，计算机辅助检测鲜精平均活率达到85％，平均曲线运动速度达到35微米/秒，平均直线运动速度达到20微米/秒，该精子适合用于超低温冷冻保存，将镜检合格的精子放入4℃冰箱保存备用；

(3)精子的稀释：精确量取需要被冷冻的尼罗罗非鱼精液，加入精液3倍体积的精子稀释液，使精液与稀释液的稀释比达到1∶3，精液与稀释液混匀，备用；

(4)精液的冻前平衡：将稀释后的精液放入4℃冰箱，进行冻前平衡，尼罗罗非鱼精液的冻前平衡时间为20-120分钟，20分钟为最少平衡时间，120分钟为最长平衡时间；

(5)加抗冻剂及分装：在平衡好的尼罗罗非鱼精液中直接加入抗冻剂二甲亚砜，加入的量为稀释后精液总量的8～9％，使抗冻剂在精液中的终浓度达到8％，抗冻剂加入后，混匀，分装；

(6)程序降温：程序降温是在程序降温仪中进行，程序降温仪由计算机控制，计算机被输入降温程序后，程序降温仪按照程序开始降温，将分装好的精液放入程序降温仪的冷冻室中，尼罗罗非鱼的降温程序从0℃开始，以5℃/分钟的速度降至-15℃，在-15℃停留5分钟，然后再以25℃/分钟速度从-15℃降至-85℃，最后在-85℃处平衡10分钟；

(7)进入液氮：降温完成后，直接将装有精液的麦管或冷冻管连同冷冻支架一起从程序降温仪中取出，放入液氮罐中，在-196℃温度中保存。

2.根据权利要求1所述的一种尼罗罗非鱼精子超低温保存的方 法，所述的精子稀释液为罗非鱼稀释液，其配方为：127.5mmol/L氯化钠，7.5mmol/L氯化钾，2.5mmol/L碳酸氢钠，2.0mmol/L氯化钙，该稀释液渗透压为293.0mOsM，pH为8.5，放置在4℃冰箱保存。