[发明专利]抑制水牛TREM1基因表达的shRNA、慢病毒表达载体及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及水牛髓样触发受体1基因(TREM1)，尤其是一种抑制水牛TREM1基因表达的shRNA、慢病毒表达载体及其构建方法和应用。

背景技术

水牛是我国南方重要的农业生物资源，它具有适应性强、耐高温高湿、易饲养、使用年限长和乳品营养价值高等特性，如今已成为极具开发价值的家畜品种。然而，水牛的低繁殖力、较高的疾病发生率却严重制约了我国水牛产业的发展。其中，布氏杆菌病引起的母牛流产、不育在实际生产中极其常见，这不仅给畜牧业造成重大的经济损失，而且严重威胁人类健康。长期以来，对布氏杆菌病的治疗手段主要是使用抗菌素和疫苗，前者容易产生耐药性，后者免疫效果不稳定、持续时间短。因此，如何有效控制布氏杆菌病仍是一项重大挑战，亟需寻求一种新的防治途径。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种抑制水牛TREM1基因表达的shRNA、慢病毒表达载体及其构建方法和应用。

为解决上述技术问题本发明采用如下技术方案：

抑制水牛TREM1基因表达的shRNA，该shRNA为shRNA-TREM194或shRNA-TREM294，它们都包含19nt的siRNA正义链，9nt的loop环，19nt的siRNA反义链和终止信号；

loop环的碱基序列为TTCAAGAGA；

终止信号的碱基序列为TTTTTTT；

shRNA-TREM194的正义链具有序列表SEQ.ID.No.3的碱基序列，其反义链具有序列表SEQ.ID.No.4的碱基序列；

shRNA-TREM294的正义链具有序列表SEQ.ID.No.5的碱基序列，其反义链具有序列表SEQ.ID.No.6的碱基序列。

上述抑制水牛TREM1基因表达的shRNA的慢病毒表达载体，该载体是：

pSicoR-GFP-shTREM-194或pSicoR-GFP-shTREM-294。

上述抑制水牛TREM1基因表达的shRNA的慢病毒表达载体的构建方法，该慢病毒表达载体由合成的shRNA-TREM194或shRNA-TREM294分别克隆入慢病毒表达载体pSicoR-GFP中而得。

上述抑制水牛TREM1基因表达的shRNA在抑制水牛TREM1基因表达方面的应用。

上述抑制水牛TREM1基因表达的shRNA的慢病毒表达载体在抑制水牛TREM1基因表达方面的应用。

上述抑制水牛TREM1基因表达的shRNA在制备防治水牛布氏杆菌病药物方面的应用。

上述抑制水牛TREM1基因表达的shRNA的慢病毒表达载体在制备防治水牛布氏杆菌病药物方面的应用。

发明人通过了解布氏杆菌病发生的分子机制，研究其信号转导通路为其防治提供新的思路和方向。髓样触发受体1(TREM1)是专一表达于中性粒细胞、CD14单核/巨噬细胞等髓样细胞表面的跨膜糖蛋白，由其介导的信号通路在炎症反应和级联放大中起重要作用，它还与Toll样受体-4(TLR-4)在LPS所致炎症反应中存在协同效应。因此，作为革兰氏阴性菌脂多糖LPS诱导的免疫反应信号路径中一个重要的靶基因，抑制TREM1基因的表达有可能改变一些其他相关因子的表达。

为此，发明人利用分子和细胞生物学技术，首先克隆得到水牛髓样触发受体1(TREM1)全长编码区，构建了水牛TREM1基因融合蛋白表达载体，设计并构建水牛TREM1基因shRNA慢病毒表达载体；然后，采用脂质体转染方法将水牛TREM1基因融合蛋白表达质粒和其shRNA慢病毒表达载体共转入293细胞，收集细胞检测水牛TREM1基因在293细胞中的表达，快速筛选获得高效抑制水牛TREM1基因的shRNA干扰序列。本发明研究工作包括以下基本步骤：

<1>水牛TREM1基因的克隆、融合蛋白表达载体的构建及其表达检测

克隆得到水牛TREM1基因mRNA的ORF全长序列，经过测序验证序列正确后，将其定向插入pDsRed-N1载体中，构建水牛TREM1基因的融合蛋白表达载体，酶切验证阳性重组质粒pDsRed-N1-TREM1；重组质粒pDsRed-N1-TREM1经脂质体转染方法导入293细胞，细胞培养48h后，荧光显微镜下观察细胞荧光表达情况；收集细胞，采用RT-PCR方法检测水牛TREM1基因在293细胞中的表达。