[发明专利]产石杉碱甲的离体蛇足石杉叶状体诱导和增殖的培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种植物生物技术，即离体诱导和增殖的培养方法，尤其涉及一种产石杉碱甲的离体蛇足石杉叶状体诱导和增殖的培养方法。

背景技术

蛇足石杉Huperzia serrata(Thunb.ex Murray)Trev.，又名千层塔、蛇足石松、蛇足草等，为石杉科石杉属蕨类植物，全草入药。自1972年国内首次报道该植物中的生物碱-石杉碱甲(hupenine A，Hup-A)具有横纹肌松驰作用，以后深入研究发现该生物碱是一种强效、可逆和高选择性乙酰胆碱酯酶抑制剂。在低剂量Hup-A下对乙酰胆碱酯酶(Ach E)有强大的抑制作用，使分布区内神经突触间隙的乙酰胆碱(Ach)含量明显升高，从而增强神经元兴奋传导，强化学习与记忆脑区的兴奋作用，起到提高认知功能、增强记忆保持和促进记忆再现的作用。是目前国内最为成功的治疗阿尔茨海默病(老年性痴呆症)的药物。石杉碱甲Hup-A药物主要来源于天然蛇足石杉全草，由于石杉碱甲的特殊疗效，国内外学者对它的全合成、衍生物及类似物的合成作了大量的工作，亦因Hup-A特殊的分子结构，人工合成费时费力，代价高，至今几乎没有得到活性比天然Hup-A更好的衍生物和类似物，因此人工合成的Hup-A及其类似物离商品化生产还有较长距离，随着老年化社会到来，阿尔茨海默病(老年性痴呆症)已成为人类的第四大病魔，直接导致国际市场上Hup-A的供应缺口越来越大，自然千层塔资源匮乏凸显。

由于蛇足石杉等石杉科植物生长于深山密林，生境条件特殊，很难解决石杉科植物大面积的人工栽培。采取石杉科植物离体组织培养能开发石杉属植物中Hup-A资源，但因外植体消毒及其生长分化困难，目前国内外尚未突破其有效的技术。而蛇足石杉离体培养是开发其原植物快繁或生物技术生产天然石杉碱甲(Hup-A)资源的重要技术平台，必须首先建立有效的离体培养无性增殖体系。

发明内容

本发明的目的在于提供一种产石杉碱甲的离体蛇足石杉叶状体诱导和增殖的培养方法，该方法简单，便于大规模生产使用。

本发明是这样实现的，方法步骤为：

(1.1)材料：蛇足石杉(Huperzia serrata(Thunb.ex Murray)Trev.，选择健壮无病虫害的庐山野生蛇足石杉植株，取当年抽生约3cm长的新枝；

(1.2)对外植体清洗消毒；

(1.3)外植体接种在叶状体分化启动培养基上培养至切口处出现绿色小凸点，继续在叶状体分化启动培养基上培养10～15天，绿色小凸点发育成可辨的叶状体组织，此时的叶状体组织迅速增殖；叶状体分化启动培养基：1/2(6，7-V)+NAA0.1～1.0mg/L，蔗糖用量20～30g/L；

(1.4)将诱导增殖的叶状体组织分割成小块，每瓶45ml左右培养基接种1.0g至1.5g，转接到叶状体继代增殖培养基上培养，叶状体继代增殖培养基：6，7-V+NAA0.1～1.5mg/L或IAA0.1～1.0mg/L，蔗糖用量20～30g/L；

(1.5)叶状体分割继代；一小部分叶状体切割作继代小块，接种到继代增殖培养基上继代培养，以后每40～50天转代一次，每世代叶状体生物量鲜重比接种量增加8～13倍，建成叶状体无性繁殖系；另一大部分叶状体收获可提取石杉碱甲。

本发明方法所用的培养基如下：

(1)适用的基本培养基：6，7-V，并蔗糖用量范围20～30g/L，

(2)叶状体分化启动培养基：1/2(6，7-V)+NAA0.1～1.0mg/L；

(3)叶状体继代增殖培养基：6，7-V+NAA0.1～1.5mg/L或IAA0.1～1.0mg/L；以上培养基的pH值5.8～6.0、琼脂粉质量分数0.6％，并在温度118～120℃暨压力0.8～1.0公斤/平方厘米的高温高压下灭菌25min。

本发明的培养条件如下：

(1)培养参数：恒温24±2℃，相对湿度60％～70％，光照强度为1000～1500lx，日照时长11～14h/d；

(2)技术参数：外植体污染率低于10％～20％；叶状体诱导率50％～80％；每世代叶状体生物量鲜重比接种量增加8～13倍；继代周期40～50d；本发明建立了生产石杉碱甲的蛇足石杉原植物再生叶状体组织的离体无性增殖系，该叶状体能生产积累石杉碱甲。