[发明专利]一株无色杆菌及其不对称催化还原碳碳双键的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物化学技术领域，具体涉及一株无色杆菌并应用该菌转化(Z)-3-芳基-3-氰基-丙烯酸，环状酰亚胺和不饱和硝基化合物制备光学纯缺电子烷烃化合物的方法，是无色杆菌属首次应用于不对称催化还原碳碳双键。 

背景技术

光学纯缺电子烷烃化合物是有机合成中的重要合成块，可以用来制备光学纯手性药物。碳碳双键还原酶(enoate reductase)不对称催化还原带有强吸电子基团的碳碳双键，可同时得到具有一个或两个手性中心的光学纯缺电子烷烃化合物，是广泛用来制备手性缺电子烷烃类的方法之一(Stuermer et al.2007 Asymmetric bioreduction of activated C＝C bonds using enoate reductases from the old yellow enzyme family.[Review].Curr Opin Chem Biol 11：203-213)。近几十年来，随着不对称催化还原带有强吸电子基团的碳碳双键的快速发展，越来越多合成家开始关注碳碳双键还原酶的新酶源的开发及底物谱的扩增。经过数十年的探索，已经从许多不同的生物来源中得到了碳碳双键还原酶，如高等植物(地钱，长春花，烟草，番茄等)，细菌和真菌(Toogood et al.2010 Biocatalytic Reductions and Chemical Versatility of the Old Yellow Enzyme Family of Flavoprotein Oxidoreductases.Chemcatchem 2：892-914)。由于微生物具有培养简单，周期短等特点，所以在全细胞催化的生物转化中，绝大数为微生物。相比之下，植物细胞培养比较复杂，不仅需要光照，而且周期较长，因此很少用于生物转化中。 

碳碳双键还原酶不对称催化还原的底物类型主要有：烯醛、烯酮、炔酮、不饱和硝基、不饱和硝基酯、不饱和腈、不饱和羧酸及其衍生物(Toogood et al.2010 Biocatalytic Reductions and Chemical Versatility of the Old Yellow Enzyme Family of Flavoprotein Oxidoreductases.Chemcatchem 2：892-914)。与生物催化羰基还原相比，生物催化碳碳双键还原的研究较少，商品化的碳碳双键还原酶更少(Chaparro-Riggers et al.2007Comparison of three enoate reductases and their potential use for biotransformations.Adv Synth Catal 349：1521-1531)。其主要原因是酶的活力低、稳定性差，不适合应用。因此，新型酶源的发掘对于发展碳碳双键还原酶具有重要意义。 

发明内容

本发明的目的是公开一株无色杆菌，该菌于2011年10月31日在中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为：CCTCC M 2011369，分类命名：Achromobacter sp.JA81， 并利用该菌具有生产高活力、高对映选择性的碳碳双键还原酶的特性，还原底物(Z)-3-芳基-3-氰基-丙烯酸制备光学纯(R)-3-芳基-3-氰基丙酸，该(R)型产物是合成光学纯γ-氨基丁酸的关键手性中间体。同时，该菌还可以催化环状酰亚胺和不饱和硝基化合物制备光学纯缺电子烷烃类化合物。为无色杆菌首次用于不对称催化还原碳碳双键。 

本发明无色杆菌(Achromobacter sp.JA81)的筛选方法： 

以柠檬醛和(Z)-2-苯基丁-2-烯腈为唯一碳源对来自成都龙泉果园和四川师范大学果园的土壤样品进行富集，得到纯培养菌株46株，以此46株菌株对模式底物马来酰亚胺进行生物转化，得到活力菌株16株，将此16株菌株对目标底物(Z)-3-苯基-3-氰基-丙烯酸进行生物转化，对目标底物有活性的菌株进行进一步的鉴定。经筛选得到本发明涉及的无色杆菌JA81。具体方案见实施例。 

以无色杆菌JA81作为生物催化剂，转化目标底物(Z)-3-苯基-3-氰基-丙烯酸生成相应的(R)-3-苯基-3-氰基丙酸。具体方法如下： 

1.菌株培养： 

斜面保存培养基组分为：胰蛋白胨1g/100mL；酵母提取物0.5g/100mL；NaCl 1g/100mL；琼脂粉2g/100mL；