[发明专利]用羟胺切割法制备天蚕素AD和蛙Buforin II融合抗菌肽及其用途

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域。具体涉及复合抗菌肽天蚕素AD和蛙Buforin II的制备方法。 

背景技术

抗菌肽可通过干扰、阻断多条细菌代谢途径，发挥胞内杀伤作用，从而抑制、杀灭细菌。不同种类、结构的抗菌肽可以攻击不同的胞内靶点发挥其抗菌作用，某些种类的抗菌肽亦可兼具胞膜攻击作用和胞内杀伤作用，且存在多个作用靶点。由于抗菌肽作用机制及靶点的多样化，使细菌不易通过变异产生耐药性。并且，某些抗菌肽与传统抗菌药物联合使用时还具有协同作用。因此，抗菌肽有望成为新一代抗菌药物或辅助治疗药物。 

天蚕素(Cecropins)是第一个被发现的动物抗菌肽，1980年，由Boman等从天蚕蛹中分离得到。该类多肽抗生素一般含有37～39个氨基酸残基，不含半胱氨酸，其N端区域具有强碱性，可形成近乎完美的双亲螺旋结构，而在C端区域可形成疏水螺旋，两者之间有甘氨酸和脯氨酸形成的铰链区，N端在生理浓度下带正电，C端均被酰胺化，酰胺化对其抗菌活性具有重要作用。所有天蚕素类抗菌肽其2位均为Try，这是该类抗菌肽最保守结构，天蚕素B、D分别与A有65％和62％同源性，表明天蚕素在分子结构上具有同源性，上述结构是抗菌肽破坏菌膜的基础。天蚕素类抗菌肽的作用机制与其电荷数和中间的柔性部位有直接关系是天蚕素类抗菌肽的作用机制假说。 

抗菌肽Cecropin AD是人工合成的由Cecropin A的N端1～11肽段和Cecropin D的C端12～37肽段组成的杂合肽。Chen等在枯草芽孢杆菌中成功地表达了高抗菌活性的抗菌肽Cecropin AD，且表达产物具有良好的生物学稳定性。 

抗菌肽Buforin II是韩国学者Park等从亚洲蟾蜍的胃组织中分离纯化的有21个残基的抗菌肽，其抗菌活性很强，抗菌谱广，在不破坏细胞膜的前提下，高效穿过细胞膜后进入胞质强烈结合DNA，从而抑制微生物的生长。 

Buforin II虽然理化性质，结构和其他α螺旋多肽类似，但其作用机制已被提出和多数作用于膜的多肽有所不同，Buforin II和Pyrrhocoricin、indolicidin，以及富含Pro、Arg的抗菌肽PR-39作用机制相似，但也有区别。Buforin II在不引起细胞膜溶解的情况下，能快速穿透质膜，并于胞内累积，通过与核酸分子结合，杀灭细菌。Buforin II的C端区域是组蛋白H₂ADNA结合基序的一部分，在于DNA的相互作用中有重要作用，是Buforin II的杀菌基础。进一步研究Buforin II及其氨基酸突变体与DNA分子的相互作用时发现，Buforin II类抗菌肽与 DNA分子的亲合能力与其抗菌能力呈正相关。同时，Buforin II与DNA分子结合不仅存在静电相互作用，而且存在着特异性结合位点。 

由于从动物或微生物中提取抗菌肽的产量少，成本高，所以用现代生物技术表达抗菌肽成为目前研究的热点。目前抗菌肽基因工程表达主要在大肠杆菌和酵母菌系统中进行。酵母菌表达体系具有直接分泌表达抗菌肽的潜力，但酵母菌生长周期长，含较多碱性氨基酸的抗菌肽易被降解，表达效率并不高；该表达系统还存在N端信号肽剪切不完全，直接影响到抗菌肽的活性；同时还存在对表达的抗菌肽进行修饰的潜在问题，如糖基化、甲基化等。大肠杆菌表达系统具有生长快、表达量高、对表达抗菌肽不存在修饰等优点，但抗菌肽在大肠杆菌中直接表达、对大肠杆菌本身具有毒性，一般采用融合表达策略。然而现在通用的大肠杆菌融合表达方式是采用大肠杆菌自身蛋白作为融合蛋白对抗菌肽进行表达。如采用两种不同抑菌机制的抗菌肽融合表达，产物在未形成正确结构时不会对宿主菌产生毒性，并且能够提高表达效率，两种抗菌肽切割成独立后便具有抑菌效果，两种协同作用能够增强抑菌效果。 

发明内容

本发明用大肠杆菌表达系统高效表达含两种不同抑菌机制的抗菌肽融合蛋白，并在融合蛋白的N端与his标签之间以及在两种抗菌肽之间引入了羟胺切割位点Asn-Gly，羟胺是一种廉价的化学试剂可以专一性的切割蛋白和多肽中的Asn-Gly肽键。从而使生产成本降低，纯化工艺简化。 

本发明提供了高效表达含两种不同抑菌机制的抗菌肽融合蛋白的表达质粒pET-Trx-CAD-Buforin II，其包N端有3个His形成立体His-patch，序列中有2个羟胺切割位点，有利于表达纯化。 

本发明提供的宿主细胞是E.coli BL21(DE3)plysS，具有氯霉素抗性。