[发明专利]玉米逆境诱导型启动子及活性分析

说明书

技术领域

本发明属生物工程技术领域，具体涉及一种来源于玉米干旱DRE-binding protein3基因并在植物中高度表达的干旱诱导型启动子序列，还涉及含有该启动子序列的植物干旱诱导型表达载体，以及应用该启动子生产转基因植物。

背景技术

逆境胁迫是目前农业生产中影响粮食产量最重要的因素和挑战之一。土壤退化、淡水匮乏、气候(象)多变等因素导致扣除零产出的荒芜、盐碱、滩涂地(15亿亩以上)外，每年直接由盐碱、干旱、低温等逆境胁迫造成的农作物减产仍超过总产的20％左右。在这些严重影响农作物生产的逆境因子中，干旱和盐胁迫是最主要的因素。据统计，全国每年有7亿亩农田受旱灾威胁，干旱所造成的损失几乎是其它自然灾害所造成损失的总和。特别是担负我国粮食生产任务65％以上的华北、东北和西北，恰恰是我国最缺水和最干旱的地区。

解决粮食生产中严重的多元逆境胁迫问题，提高其产量，除了常规育种技术以外，基于基因遗传转化的生物育种技术是一个重要的选择。通过转基因技术提高作物抗逆性是有效应对逆境挑战的根本途径，而分离、克隆抗逆关键基因是解决这一重要问题的核心与关键，克隆和组建逆境诱导型启动子是进行多抗基因转化实现分子育种目标的重要保障。目前，从实践上应用的启动子来看，仍以CaMV35S、玉米Ubiquitin promoter等组成型表达启动子为主，而且多为天然分离DNA片段的直接应用，无法实现高效、可控和特异(定点、定时、定量)的调控，而且由35S启动的基因过表达会使转基因植物表型产生一些负面效应，如矮化等。因此克隆并应用胁迫诱导型启动子来启动抗逆基因的表达，在提高植物的抗性方面具有重要作用。

目前，许多学者对逆境胁迫诱导型启动子进行了研究。如：rd29A启动子是缺水等逆境诱导启动子。Kasuga等用组成型的CaMV 35S启动子和rd29A启动子分别驱动DREB1A基因转化拟南芥(Kasuga M，Liu Q，Miura S，，1999)。CaMV 35S启动子驱动的DREB1A基因的过量表达激活了许多其他耐胁迫基因的表达，例如rd29A、Kin 1、Cor6.6等。转基因植株都比非转基因植株的抗旱、抗盐、抗冻能力显著提高。但是，过量表达DREB1A基因也导致了植株在正常生长条件下生长迟缓；与之相反，由胁迫诱导型启动子rd29A驱动的基因表达不仅使植株有更强的胁迫耐受力还对其生长有着最小的负面影响。OsABA2基因编码玉米黄质环氧化酶。OsABA2基因启动子含有一个MYBR元件和5个MYCR元件，表明它的表达与响应ABA诱导有关。Rai等用OsABA2基因启动子与GUS构建的表达载体转化玉米，实验表明在没有胁迫的条件下，由OsABA2基因启动子驱动的的转基因株系的GUS活性要比由Act1驱动的对照组低得多。缺水处理后，叶片中由OsABA2基因启动子驱动的GUS的表达量是无缺水处理对照组的5倍；而由Act1启动子驱动的对照组GUS的表达量没有任何增加(Rai M，He CK，2009)。cor15a基因启动子具有低温诱导表达的特性，朱青等从拟南芥Columbia生态型的基因组中扩增出cor15a基因的启动子片段，将其插入pBI121的GUS基因和NOS终止子上游构成表达载体pLB，获得转化株。GUS组织染色结果表明，经过低温处理的转基因马铃薯的叶片均表达了GUS产物，而没有经过低温处理的转基因马铃薯及非转基因植株则检测不到GUS活性(朱青，宋波涛等，2004)。Rrandl等分析了大豆Gmhsp17.32B热诱导启动子在转基因烟草中的调节作用，并在转基因植物的种子上测得GUS活性，发现该启动子具有一段热诱导因子(HSE)的同功序列。杜鹃等从小麦中克隆了mwcs120启动子，构建了诱导型瞬时表达质粒pmwGUS，用pmw-GUS转化玉米愈伤组织和烟草叶片证明，mwcs120启动子在单子叶和双子叶植物中均可受低温等逆境诱导，可以用于驱动结构基因的表达(杜娟，朱祯，李晚忱，2005)。Nazmul等分离了1.6kb的AmCMO基因上游启动子片段，5′端缺失分析发现，翻译起始点上游410bp片段中含有盐胁迫响应序列，300mmol/L NaCl处理24h后，GUS活性显著提高，AmCMO基因上游410bp片段可以作为盐诱导启动子(Nazmul HB，Akira H，Nana Y，2007)。