[发明专利]一种难治性哮喘检测标记物的筛选方法及其应用

摘要

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种难治性哮喘检测标记物的筛选方法及其应用。本发明首次发现了CTSC基因表达与哮喘严重程度及难治性哮喘的发生发展相关，通过筛选难治性哮喘的非侵入式的诱导痰标志物，检测诱导痰中CTSC基因表达量，并将其用于制备难治性哮喘的早期诊断试剂盒。本发明有助于难治性哮喘的进展评估，可实现难治性哮喘的早期无创诊断和哮喘的早期治疗，具有创伤小、检测便捷、敏感性高、患者接受程度高的优势。

主权项

1.一种难治性哮喘检测标记物的筛选方法，其特征在于：所述难治性哮喘检测标记物为CTSC基因，其按照以下步骤进行：(1)收集临床明确诊断为哮喘病人及健康对照测试者的诱导痰中原代气道上皮细胞：进行细胞分类和活力检测，合格标准为上皮细胞<10个/低倍镜视野，白细胞>25个/低倍镜视野，细胞存活率>40％，筛选鉴定细胞，采用免疫磁珠分选法进行标记并进一步筛选纯化原代气道上皮细胞；(2)mRNA转录组测序分析：①进一步筛选纯化后，加入洗脱、片段化和随机引物组成的缓冲液，将磁珠94℃高温孵育，洗脱结合的mRNA同时进行热断裂，使片段分布在100‑300bp之间；以片段化且结合了随机逆转录引物的短片段mRNA为模板，在Invitrogen逆转录酶SuperScript IV的作用下进行第一链cDNA的合成，向合成一链cDNA的体系中加入二链合成预混体系，水解消化RNA/cDNA杂合链上的RNA，并以一链cDNA为模板，DNA聚合酶合成二链cDNA，经过Agencourt AMpure XP磁珠纯化，最终得到双链ds cDNA；②向纯化后的ds cDNA加入末端补齐体系，其是含有修复cDNA两端不规则末端的酶组合，最终得到5’端含有磷酸基团的平末端ds cDNA短片段文库；向上述体系中加入3’末端加“A”缓冲反应体系；向上述反应体系中加入连接缓冲液和双链测序接头；③对于加上接头的文库，应用Agencourt SPRIselect核酸片段筛选试剂盒在纯化文库的同时，进行片段大小筛选，最终筛选出片段峰值在300bp的原始文库；④用聚合酶放大原始文库，PCR扩增循环数控制在12‑15之间，放大后的文库经过磁珠纯化即成为可以上机的测序文库；⑤对构建好的测序文库进行质检和定量；⑥对于质检合格的文库经过稀释后按等摩尔数对多个样品进行混样上机，对文库进行测序；⑦对测序结果进行生物信息学分析，使用tophat2将质量控制后的序列和参考基因组进行比对，利用cufflinks的分析流程对已知的基因和转录本进行表达定量，利用cuffdiff软件分析差异表达基因，当adj.p‑value<0.05时，认为mRNA显著差异表达；(3)利用健康对照、非难治性哮喘及难治性哮喘患者气道上皮细胞的mRNA转录组测序数据进行差异基因分析，通过对差异基因进行信号通路和富集分析，明确与气道重塑相关性最高的差异基因，确定难治性哮喘的候选生物标志物：①筛选差异表达基因：通过R语言筛选相对于健康对照与非难治性哮喘，在难治性哮喘患者气道上皮细胞差异表达的基因，并通过Benjamini‑Hochberg方法对p值进行校正；②差异表达基因筛选参数：Log FC>1,adj.p‑value<0.05；③信号通路和富集分析：通过metascape.org在线网站对差异表达基因进行信号通路和富集分析，筛选出与气道重塑相关性最高的差异表达基因；④根据信号通路和富集分析结果，CTSC是与气道重塑的相关性最高的差异基因，可能是难治性哮喘诊断与疗效评估的生物标志物；(4)采用大样本量qPCR验证CTSC基因的差异表达，最终确定CTSC是难治性哮喘诊断与疗效评估的生物标志物。