[发明专利]一种快速高效的楸遗传转化方法

摘要

本发明公开了一种快速高效的楸遗传转化方法。本方法利用楸子叶为外植体诱导胚性愈伤组织，然后进行农杆菌介导的遗传转化，主要步骤：遗传转化受体的获得与增殖，包括子叶愈伤组织的诱导、胚性愈伤组织的诱导和增殖；携带目的基因的农杆菌的制备；胚性愈伤组织的遗传转化；植株再生及生根；再生植株检测；转基因植株炼苗及移栽。采用本发明的方法对楸进行遗传转化，80‑100天获得阳性转化植株，转化效率92.23%‑97.14%。本发明周期短、操作简单、遗传转化效率高，为楸基因功能验证及分子育种提供了重要的技术支撑，加快了楸新品种的培育进程。

主权项

1.一种快速高效的楸遗传转化方法，其特征在于，包括如下步骤：(1) 遗传转化受体的获得与增殖：a) 子叶愈伤组织的诱导：成熟的楸种子经75%酒精表面灭菌60 s，无菌水冲洗2次，再浸泡于0.1%氯化汞溶液18 min，无菌水冲洗5次后平铺于愈伤诱导培养基上，25‑28℃，暗培养20 d，获得愈伤组织；b) 胚性愈伤组织的诱导：将诱导出的黄绿色子叶愈伤组织转置于胚性愈伤组织诱导培养基，25‑28℃，光强1500lx，12 h/d的光下培养，每隔20 d继代，直至产生胚性愈伤组织；c) 胚性愈伤组织的增殖：将诱导出的胚性愈伤组织转置于胚性愈伤组织增殖培养基，25‑28℃，光强1500lx，12 h/d的光下培养，每隔20 d继代，使胚性愈伤增殖，以满足后续的遗传转化需求；(2) 携带目的基因的农杆菌的制备：将含有目的基因的植物表达载体通过冻融法导入农杆菌感受态中，挑取单克隆，目的基因PCR检测确定阳性单克隆后，过夜摇菌，收集菌体，由重悬液MS₀ (l)重悬；(3) 胚性愈伤组织的遗传转化：将增殖的胚性愈伤组织接入重悬的农杆菌菌液中，菌液完全浸没胚性愈伤组织，100 rpm，20‑30 min，吸水纸吸干胚性愈伤组织表面的菌液后，平铺于共培养培养基MS₀ (s)，25‑28℃，暗培养24‑48 h；(4) 植株再生及生根：将共培养后的胚性愈伤组织转置于添加抗生素的分化培养基，并将其堆积为大小合适的愈伤堆，进行转化子的选择培养，25‑28℃，光强1500lx，12 h/d的光下培养，每隔20 d继代至植株再生，再生苗株高2.5‑4 cm转置于生根培养基中进行生根培养；(5) 再生植株检测：对步骤(4)中的抗性再生植株幼苗进行报告基因的表达检测，同时，取再生植株的叶片，提取DNA，进行目的基因的PCR检测；(6) 转基因植株炼苗及移栽：将根系健壮的转基因阳性苗的瓶盖拧开后放置7d炼苗，然后取出阳性苗，洗净根上滞留的培养基后移入装有营养土(泥炭土：珍珠岩=3:2)的花盆中并放置在保温棚中，一周后移出。