[发明专利]一种通过桃儿七愈伤不定根生产鬼臼毒素的方法

摘要

本发明公开了一种通过桃儿七愈伤不定根生产鬼臼毒素的方法，通过获取无菌种胚、胚性愈伤组织诱导、不定根的生长和鬼臼毒素的诱导生产等步骤，建立了一套耦合细胞工程和发酵工程的手段生产鬼臼毒素的方法。本方法操作简单，产量高，且愈伤组织不继代褐化程度低；通过桃儿七内生菌粉红粘帚霉fhnzm发酵液及一些植物生长调节剂处理不定根，有效提高了鬼臼毒素含量。

主权项

1.一种通过桃儿七愈伤不定根生产鬼臼毒素的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)获取无菌种胚：将新鲜的桃儿七种子消毒，取出无菌种胚；(2)胚性愈伤组织诱导：将上述种胚接种于愈伤组织诱导培养基，黑暗条件下，23℃培养40天左右，至明显看到带有不定根根原基的胚性愈伤组织，获得外植体；胚性愈伤组织诱导培养基配方:MS基本培养液、蔗糖50g/L、酸水解酪蛋白1g/L、琼脂5g/L、生物素0.2mg/L、吲哚乙酸2‑4mg/L、玉米素2‑4mg/L、油菜素内酯0.01‑0.05mg/L、毒莠啶2mg/L；(3)不定根的生长：将上述外植体转接入不定根生长培养基，黑暗条件下，20℃培养40天，至不定根长度5+1cm；不定根生长培养基配方：1/2MS基本培养液、蔗糖20g/L、琼脂5g/L、萘乙酸浓度为0.2mg/L、吲哚乙酸浓度为0.2mg/L；(4)鬼臼毒素的诱导生产：将上述不定根接入鬼臼毒素诱导培养基，黑暗条件下，20℃培养7天，收集不定根，洗净烘干后，用体积比1:1的甲醇/氯仿混合液超声提取1h，过滤，挥干，甲醇定容，即为鬼臼毒素提取液；鬼臼毒素诱导培养基配方：1/2MS基本培养液、蔗糖20g/L、粉红粘帚菌发酵液接种量为体积比20％；粉红粘帚霉发酵液制备：将粉红粘帚霉接入PDA培养基，30℃，160r/min振荡培养，培养9d后取样，培养物经虑纸过滤，滤液3000r/min离心15min，上清液经0.22μm滤膜过滤，收集滤液‑20℃保存备用；