[发明专利]一种构建永生化猪肝星状细胞系的方法、永生化猪肝星状细胞系和应用

摘要

本发明提供一种构建永生化猪肝星状细胞系的方法、永生化猪肝星状细胞系和应用，涉及永生化细胞技术领域，本发明所述方法从猪肝脏中分离得到正常的猪肝星状细胞，以SV40LT过表达慢病毒转染，得到永生化的猪肝星状细胞系。本发明采用包含SV40LT序列的慢病毒载体对猪肝星状细胞进行永生化，具有可感染非分裂期细胞、容纳外源性基因片段大，可长期表达等优点。本发明所述方法构建的永生化猪肝星状细胞系呈伸展状态生长，有伪足，细胞轮廓清晰，细胞完整，具有与原代猪肝星状细胞类似的典型形态学特征；所得永生化猪肝星状细胞系传代10代后，细胞形态和特征与第1代细胞无明显差别，该构建的永生化猪肝星状细胞系可在药物筛选中应用。

主权项

1.一种构建永生化猪肝星状细胞系的方法，包括以下步骤：(1)将猪肝脏组织破碎后与质量浓度0.05～0.2％的Ⅳ型胶原酶溶液混合，35～38℃加热0.5～2h，得到酶解复合物；(2)以180～240目筛网过滤所述酶解复合物，取滤液，得到全肝细胞悬液；(3)将全肝细胞悬液进行第一离心，固液分离，得到第一上清液；所述第一离心的转速为300～600rpm；(4)将所述第一上清液进行第二离心，固液分离，所得沉淀为猪肝星状细胞；所述第二离心的转速为1200～1800rpm；(5)将所述猪肝星状细胞接种于容器的孔中，加入星状细胞完全培养基培养至贴壁后换液，依次加入新的星状细胞完全培养基和SV40LT过表达慢病毒进行转染；所述SV40LT过表达慢病毒具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；(6)将转染后的猪肝星状细胞传代3～4次后，筛选阳性克隆，得到永生化猪肝星状细胞系。