[发明专利]一种在细胞系中条件性敲除必需基因的方法有效
| 申请号： | 201910022784.0 | 申请日： | 2019-01-10 |
| 公开（公告）号： | CN109777830B | 公开（公告）日： | 2022-05-20 |
| 发明（设计）人： | 王永明;王贝 | 申请（专利权）人： | 复旦大学 |
| 主分类号： | C12N15/85 | 分类号： | C12N15/85;C12N15/90 |
| 代理公司： | 上海正旦专利代理有限公司 31200 | 代理人： | 陆飞;王洁平 |
| 地址： | 200433 *** | 国省代码： | 上海;31 |
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| 摘要： | 本发明属于基因工程领域，具体为一种在细胞系中条件性敲除必需基因的方法。本发明首先构建双质粒系统：敲除质粒(KO质粒)编码用于敲除必需基因的Cas9和sgRNA，营救质粒(Rescue质粒)编码由Tet‑off系统调控的外源补偿基因，然后将两个质粒同时转入细胞后用药筛若干天，分选单克隆，通过测序鉴定，获得必需基因纯合敲除细胞系。本发明中可以通过加Doxcyclin关闭外源基因表达，以研究必需基因的功能。另外，本发明中Rescue质粒可以被另外一个含有不同抗性基因的Rescue2质粒替换，Rescue2质粒上编码必需基因的突变体，用以研究必需基因突变体的功能。本方法操作简单，实验周期短。 | ||
| 搜索关键词： | 一种 细胞系 条件 必需 基因 方法 | ||
【主权项】：
1.一种在细胞系中条件性敲除必需基因的方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)构建双质粒系统，双质粒系统包含KO质粒和Rescue质粒，KO质粒含有用于敲除内源基因的sgRNA和Cas9基因，用于调控外源基因表达的tTA基因和负责质粒在真核细胞中复制的EBNA1和oriP元件；Rescue质粒含有补偿敲除的必需基因的外源补偿基因，用于筛选转染成功的细胞的抗药基因和在EBNA1蛋白的作用下可以使质粒在真核细胞中复制的oriP元件；将靶向目的基因的sgRNA克隆到KO质粒上，将外源补偿基因cDNA克隆到Rescue质粒上；(2)将双质粒系统转染到细胞中，在药物筛选下培养若干天，分选单克隆，测序鉴定，即筛选出必需基因纯合敲除的细胞系。
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