[发明专利]一种EGFR基因的FISH探针的制备方法

摘要

本发明属于生物化学领域，具体属于生物化学相关的测定或检测领域；更具体涉及一种EGFR基因的FISH探针的制备方法，及由该方法制备出的探针。本发明提供的方法使用BAC克隆、酶切打断以及不对称扩增等方法制备探针文库，使得产品灵敏度、特异性以及信号强度均得到有效提高。

主权项

1.一种 EGFR 基因的 FISH 探针文库的制备方法，其特征在于：所述的制备 方法包括以下步骤：/n(1)制备得到探针 1；/n(2)酶切打断步骤(1)获得的探针 1，得到探针 2；/n(3)给步骤(2)获得的探针 2 添加接头，得到探针 3；/n(4)对步骤(3)获得的探针 3 进行不对称扩增，得到 FISH 探针文库； 所述的步骤(1)中的探针 1 为探针 1A 和探针 1B，所述的探针 1A 为针对 EGFR/n的基因的一条探针；所述的探针 1B 为针对人类 7 号染色体着丝粒区域的一条探针；所述探针 1A 为 1ng/μL 的 BAC 克隆 RP11-443C12，所述的探针 1B 为 1ng/μL 的BAC 克隆 RP11-1146G20；/n所述的步骤(2)中的酶切打断探针 1 使用的酶为限制性内切酶混合液，所述 的限制性内切酶混合液包括 AluI、HpyCH4V、MluCI 和 BfaI，且其体积比为 1:2:0.5:0.4；/n所述的步骤(3)给探针 2 添加接头的方法为：通过 T4 DNA 连接酶将探针 2/n和接头序列连接；/n所述的接头序列为 A1 接头和 A2 接头，其中 A2 接头 5’端第一个碱基 C 含 有磷酸化修饰：/n所述的 A1 接头的核苷酸序列为 SEQ ID NO：1 所示的序列：/n5’-CCTCTGTATGCGCATCCTGTGAT-3’；/n所述的 A2 接头的核苷酸序列为 SEQ ID NO：2 所示的序列：/n5’-CCATCACATCTCTGAGTGTCTCCGA-3’；/n所述的步骤(4)中对探针 3 进行不对称扩增，通过在扩增使用的 dNTP 中加入aminoallyl-dUTP 实现在 FISH 探针序列中掺入氨基标记的目的；/n所述的不对称扩增体系包括：dNTP、aminoallyl-dUTP、Epimark Hot start TaqDNApolymerase、引物和探针 3；所述 dNTP 由 dATP，dCTP，dGTP 和 dTTP 混 合配制而成；/n所述的 dNTP 和 aminoallyl-dUTP 的摩尔比为 4:1； 所述的 dTTP 和 aminoallyl-dUTP 的摩尔比为 1:4； 所述的引物为：/n正向引物的核苷酸序列为 SEQ ID NO：3 所示的序列：/n5’-CCTCTGTATGCGCATCCTGTGAT-3’；/n负向引物的核苷酸序列为 SEQ ID NO：4 所示的序列：/n5’-TCGGAGACACTCAGAGATGTGATGG-3’。/n