[发明专利]一种microRNA快速检测的方法

摘要

本发明公开了一种microRNA快速检测方法。首先设计与目标物两端完全互补的probe1和probe2，合成24nM的金纳米粒子，将probe1、probe2分别标记在金纳米表面，得到AuNPs‑probe1和AuNPs‑probe2溶液。当靶目标存在时，目标物与两个金探针杂交形成三明治结构，发生聚集，从而导致溶液的颜色发生酒红色到紫色的变化。本发明通过检测杂交混合液的颜色变化反应，从而间接达到检测目标物的目的，这避免了昂贵仪器的使用，成本低且操作简便，能够广泛地运用到实际的检测中。

主权项

1.一种microRNA快速检测方法，其特征在于具体步骤为：(1)用移液枪移取100mL质量百分比浓度为0.01％的氯金酸溶液于250毫升的圆底烧瓶中，置于油浴锅中搅拌加热至煮沸后，快速加入1.5mL质量百分比浓度为1％的柠檬酸钠溶液，继续搅拌加热15分钟，当溶液的颜色从最初的淡黄色逐渐变成酒红色时，停止加热，在搅拌状态下冷却至室温；得到粒径为24nm的纳米金粒子；(2)移取60μL浓度为10μmol/L probe1与60μL含10mmol/L三(2‑羧乙基)膦浓度为10mmol/L pH 5.8磷酸盐缓冲溶液中混合活化2小时，活化完毕后加入1mL步骤(1)合成的金纳米溶液，立即震荡均匀，置于黑暗环境下孵育16小时；接着分别往里加入11.3μL质量百分比浓度为10％的十二烷基硫酸钠溶液，使最终质量百分比浓度为0.1％，加入125.7μL浓度为0.1mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲溶液，使其最终浓度为10mmol/L，再加入66.16μL浓度为2mol/L NaCl溶液，使其最终浓度为0.1mol/L；在孵育24小时后使用高速离心机离心以10000转每分钟的速度离心20分钟，得到红色沉淀后分散至含0.1mol/L NaCl浓度为10mmol/L pH 7.4磷酸盐缓冲溶液中并重复清洗3次，去掉上清液，最后分散至含1mL含0.1mol/L NaCl浓度为10mmol/L pH 7.4磷酸盐缓冲溶液中，震荡均匀，得到的AuNPs‑probe1溶液在4℃下避光储存备用；所述probe1为巯基修饰的DNA片段，其碱基序列为：5`‑CTACTACCTCATTTTTTTTTTTTTTTTTTTT‑3`；(3)移取60μL浓度为10μmol/L probe2与60μL含10mmol/L三(2‑羧乙基)膦浓度为10mmol/L pH 5.8磷酸盐缓冲溶液中混合活化2小时，活化完毕后加入1mL步骤(1)合成的金纳米溶液，立即震荡均匀，置于黑暗环境下孵育16小时；接着分别往里加入11.3μL质量百分比浓度为10％的十二烷基硫酸钠溶液，使最终质量百分比浓度为0.1％，加入125.7μL浓度为0.1mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲溶液，使其最终浓度为10mmol/L，再加入66.16μL浓度为2mol/L NaCl溶液，使其最终浓度为0.1mol/L；在孵育24小时后使用高速离心机离心以10000转每分钟的速度离心20分钟，得到红色沉淀后分散至含0.1mol/L NaCl浓度为10mmol/L pH 7.4 PBS缓冲溶液中并重复清洗3次，去掉上清液，最后分散至含1mL含0.1mol/L NaCl浓度为10mmol/L pH 7.4磷酸盐缓冲溶液中，震荡均匀，得到的AuNPs‑probe2溶液在4℃下避光储存备用；所述probe2为巯基修饰的DNA片段，其碱基序列为：5`‑AACTATACAACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT‑3`；(4)取75μL AuNPs‑probe1溶液、75μL AuNPs‑probe2溶液以及20μL浓度为1.5pmol/L～78nmol/L的miRNA震荡混合均匀，将混合液置于温度为30～45℃的水浴锅中恒温孵育5～40分钟,将杂交液放置室温下下加入85μL浓度为0.3～3.6mol/L的NaCl溶液，使杂交液的最终盐浓度达到0.1～1.2mol/L，最后置于冰箱中冷冻10～70分钟；(5)将冷冻后的杂交混合液置于室温下解冻到常温状态，使用数码相机拍照做颜色对比，最后使用紫外可见光谱仪对溶液进行检测，分别在526nm和700nm出现特征峰；记录浓度为1.5pmol/L～78nmol/L目标物miRNA‑7a的紫外光谱；(6)分别取20μL与目标物miRNA‑7a同种类的序列终浓度为7.8nmol/L的miRNA‑7d、miRNA‑7e、miRNA‑7c、miRNA‑7g以及0nmol/LmiRNA‑7a按照步骤(2)～(4)进行实验操作，记录浓度为0nmol/L miRNA‑7a、7.8nmol/L的miRNA‑7a、miRNA‑7d、miRNA‑7e、miRNA‑7c、miRNA‑7g的紫外光谱；上述miRNA‑7a的碱基序列为：5′‑UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU‑3′，miRNA‑7d的碱基序列为：5′‑AGAGGUAGUAGGUUGCAUAGU‑3′，miRNA‑7e的碱基序列为：5′‑UGAGGUAGGAGGUUGUAUAGU‑3′，miRNA‑7c的碱基序列为：5′‑UGAGGUAGUAGGUUGUAUGGUU‑3′，miRNA‑7g的碱基序列为5′‑UGCGGUAGUAGUUUGUACAGUA‑3′。