[发明专利]一种基于愈伤组织分化的新疆野苹果再生体系建立的方法

摘要

本发明属于植物组织培养技术领域，涉及一种基于愈伤组织分化的新疆野苹果再生体系建立的方法，该方法是由愈伤组织及不定芽的诱导，不定芽增殖，生根培养以及炼苗和移栽步骤完成，通过本发明提供的方法，愈伤组织诱导率为100%，不定芽的最高诱导率为30%，生根和幼苗成活率分别可达85%和90%。本发明所述方法为新疆野苹果的种质保存和遗传转化研究提供基础。本发明所述方法适用于多种环境，尤其是新疆，甘肃等空气湿度低的地方，大大提高了组培植物的存活率，省时省力。

主权项

1.一种基于愈伤组织分化的新疆野苹果再生体系建立的方法，其特征在于：该方法以叶片为外植体，愈伤组织诱导及不定芽的诱导，不定芽的增殖，生根培养以及炼苗和移栽，具体操作按下列步骤进行：愈伤组织及不定芽的诱导：a、取实验室继代生长的新疆野苹果无菌苗40d叶龄大小的幼嫩完全展开叶片为外植体，去掉叶柄部分，用解剖刀垂直于叶片中央叶脉横切，将叶片等分为两部分，以叶片远轴端为接触面，接种到诱导培养基中继代2次，每25天一次，黑暗培养三周后，2000lx光照培养，光照时间16小时，培养温度为24±2℃，培养7天后，肉眼可在切口处见黄色愈伤组织，20天左右在叶片切口处的愈伤组织看到有不定芽的分化，其中诱导培养基为以MS为基础培养基，附加30g/L蔗糖，琼脂6g/L，激素为NAA 0.0‑2.0mg/L，TDZ 1.0‑5.0mg/L或6‑BA 1.0‑ 5.0mg/L，灭菌前调pH至6.0，高温高压灭菌115℃，30分钟；不定芽的增殖：b、将步骤a诱导出的不定芽切下，插到不定芽增殖培养基中，培养条件为黑暗培养三周后，2000lx光照培养，光照时间16小时，培养温度为24±2℃，培养15天后长成1‑4cm丛生芽或幼苗，增值倍数达3‑5倍，其中不定芽增殖培养基为以MS为基础培养基，附加30g/L蔗糖，琼脂6g/L，激素为6‑BA 0.4mg/L，NAA 0.0‑0.1mg/L，灭菌前调pH至6.0，高温高压灭菌115℃，30分钟；生根培养：c、将步骤b得到的3cm幼苗，沿茎基部切下，接种到生根培养基上，约10天可在茎基部看到粉红色的根尖，25天可长出3‑5条根，其中生根培养基为以1/2MS为基础培养基，蔗糖15‑30g//L，NAA 0.0‑1.0mg/L，琼脂6g/L，灭菌前调pH至6.0，高温高压灭菌115℃，30分钟；炼苗和移栽：d、取株高5cm，有3‑5条根的健壮幼苗移栽到已经湿润的基质中，基质为营养土:蛭石3:1，将幼苗移栽进基质后，在移栽盆表面覆盖扎有小洞的保鲜膜，期间每天向膜内喷水，光照强度减半，光照时间为16小时，培养温度为24±2℃，7天后揭开保鲜膜呈半开状态，正常光照下培养且仍需每天向膜内喷水，直至移栽后第一片新叶完全展开，即可完全撤去保鲜膜，此后恢复正常浇水。