[发明专利]蓝果忍冬SRAP反应体系的建立

摘要

蓝果忍冬SRAP反应体系的建立属于分子生物学领域，SRAP作为一种新型的分子标记，具有操作简单、稳定和高效等特点，广泛应用于不同作物的图谱构建、基因定位和遗传多样性分析各种研究，与其他PCR技术类似，其扩增结果易受到Tag DNA聚合酶、模板DNA、dNTPs、Mg2+、引物等反应因素的影响，因此，进行SRAP体系的优化是获得较好研究结果的先决条件。建立蓝果忍冬SRAP反应体系，能够简单、稳定、高效的获得丰富的多态性DNA，以应用于蓝果忍冬的图谱构建、基因定位和遗传多样性分析等。

主权项

1.蓝果忍冬SRAP反应体系的建立，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)采用单因素试验对体系进行优化，基本反应条件为反应总体积20μl，其中10×PCR buffer 2μl、MgCl2 2.5mmol/l、dNTPs 0.15mmol/l、引物0.1μmol/l、模板DNA 20ng、Tag DNA聚合酶1.5U，不足部分用双蒸水补足，进行反应；(2)在步骤(1)基本反应条件的的基础上，设置不同浓度梯度Tag DNA聚合酶反应；取10μl反应终产物加lμl 6×上样缓冲液混合，在1.8％的琼脂糖凝胶中电泳；电泳缓冲液为l×TAE，电泳电场强度为5V/cm，Gofdview染色，Alphalmager HP凝胶成像系统下观察照像并记录；选出有清晰明亮条带的Tag DNA聚合酶浓度；(3)在步骤(1)基本反应条件的的基础上，设置不同浓度梯度模板DNA反应；取10μl反应终产物加lμl 6×上样缓冲液混合，在1.8％的琼脂糖凝胶中电泳；电泳缓冲液为l×TAE，电泳电场强度为5V/cm，Gofdview染色，Alphalmager HP凝胶成像系统下观察照像并记录；选出有清晰明亮条带的模板DNA浓度；(4)在步骤(1)基本反应条件的的基础上，设置不同浓度梯度dNTPs反应；取10μl反应终产物加lμl 6×上样缓冲液混合，在1.8％的琼脂糖凝胶中电泳；电泳缓冲液为l×TAE，电泳电场强度为5V/cm，Gofdview染色，Alphalmager HP凝胶成像系统下观察照像并记录；选出有清晰明亮条带的dNTPs浓度；(5)在步骤(1)基本反应条件的的基础上，设置不同浓度梯度Mg2+反应；取10μl反应终产物加lμl 6×上样缓冲液混合，在1.8％的琼脂糖凝胶中电泳；电泳缓冲液为l×TAE，电泳电场强度为5V/cm，Gofdview染色，Alphalmager HP凝胶成像系统下观察照像并记录；选出有清晰明亮条带的Mg2+浓度；(6)在步骤(1)基本反应条件的的基础上，设置不同浓度梯度引物反应；取10μl反应终产物加lμl 6×上样缓冲液混合，在1.8％的琼脂糖凝胶中电泳；电泳缓冲液为l×TAE，电泳电场强度为5V/cm，Gofdview染色，Alphalmager HP凝胶成像系统下观察照像并记录；选出有清晰明亮条带的引物浓度；(7)确定蓝果忍冬SRAP最佳反应条件，在多个蓝果忍冬品种样品上检验反应体系的稳定性和可靠性。