[发明专利]一种饮用水中总大肠菌群的快速检测方法

摘要

本发明公开了一种饮用水中总大肠菌群的快速检测方法，使用大肠埃希氏标准菌株制备阳性对照样品，染色后通过流式细胞术分析，设置阈值、圈定总大肠菌群区域门；待测样品前处理后进行流式细胞术分析，根据阳性对照来确定参数计算样品中总大肠菌的细胞活性和数量。本发明通过流式细胞术，不仅能够有效快速的检测水体中总大肠菌群的总数，还能够通过特异性荧光染料，同时检测出不同细胞活性细菌：活体菌数、死亡菌数、受损菌数，科学地解析水体中总大肠菌群的实际活性状态，真实地反映饮用水中总大肠菌群的动态分布和潜在威胁。本发明的检测方法测定结果重复性好，精确度高，快速高效，可用于饮用水水质突发污染事件中总大肠菌群的检测。

主权项

1.一种饮用水中总大肠菌群的快速检测方法，其特征在于，使用大肠埃希氏标准菌株制备阳性对照样品，染色后通过流式细胞术分析，设置阈值、圈定总大肠菌群区域门；待测样品前处理后进行流式细胞术分析，根据阳性对照来确定参数计算样品中总大肠菌的细胞活性和数量；具体方法步骤如下：(一)阳性对照样品菌悬液区域门参数设置(1)制备阳性对照样品菌悬液：以大肠埃希氏菌为标准菌株，接入已灭菌的LB肉汤培养液中，37℃培养16‑20h，8000rpm/min离心5min，收集菌体加入1mLPBS缓冲液混匀，制成大肠埃希氏菌悬液并进行计数；根据计数结果以PBS缓冲液为稀释液，通过1:10、1:100梯度稀释法，制成终浓度为105‑107cells/mL的阳性对照样品菌悬液；(2)活体细胞区域门的圈定：取步骤(1)制备的阳性对照样品菌悬液中，加入荧光染料和绝对计数微球进行染色，然后进行流式细胞术分析，按照以下步骤圈门：第一步，建立FSC‑SSC散射光点图和等高线图，利用等高线图中的等高线分布，在FSC‑SSC散射光点图中，设置FSC域值为350‑500、SSC域值为300‑330，圈出总大肠菌群区域门和Beads区域门；第二步，建立FITC‑PE‑Texas Red荧光散点图，在Threshold参数设置中，设置FITC阈值大于200，排除大颗粒、非生物碎屑的干扰；第三步，设置FITC阈值为450‑500、PE‑Texas Red阈值为580‑620；第四步，将FITC‑PE‑Texas Red荧光散点图中，FITC单阳区域细菌，圈定为活体细胞区域门；(3)死亡细胞区域门的圈定：取步骤(1)制备的阳性对照样品菌悬液灭活，加入荧光染料和绝对计数微球进行染色，然后进行流式细胞术分析，在步骤(2)第四步基础上，将FITC‑PE‑Texas Red荧光散点图中，PE‑Texas Red单阳区域细菌，圈定为死亡细胞区域门；(4)受损细胞区域门的圈定：在完成步骤(2)、(3)的FITC‑PE‑Texas Red荧光散点图中，将FITC和PE‑Texas Red双阳区域的剩余细菌，圈定为受损细胞区域门；(二)待测样品的处理采集待测样品，经灭菌的滤膜过滤后，取PBS缓冲液，冲洗滤膜至无菌管，经300目筛网过滤得到待测样品浓缩液；取样品浓缩液加入荧光染料和绝对计数微球进行染色，避光孵育；(三)待测样品分析：按照步骤(一)阳性对照菌悬液区域门参数设置，将步骤(二)中完成染色的待测样品进行流式细胞术分析，采集信号并进行相关计算，计算公式如下：总大肠菌群浓度＝活体菌浓度+死亡菌浓度+受损菌浓度；经计算，分别得到待测样品的总大肠菌以及活体细胞、死亡细胞、受损细胞的浓度。