[发明专利]一种LPOR-Y193F突变体蛋白晶体的制备方法

摘要

本发明公开了一种LPOR‑Y193F突变体蛋白晶体的制备方法，具体包括获得突变的LPOR‑Y193F cDNA序列、表达载体构建、LPOR‑Y193F突变体蛋白表达、LPOR‑Y193F突变体蛋白分离、LPOR‑Y193F突变体蛋白纯化和LPOR‑Y193F突变体蛋白结晶。本发明提供了一种LPOR‑Y193F突变体蛋白晶体的制备方法，从而对LPOR‑Y193F突变体蛋白晶体的结构进行解析，为LPOR蛋白的结构解析及相位的确定奠定基础；同时对彻底阐明和确定光敏感超速蛋白的催化机理或将其工程化奠定了基础。

主权项

1.一种LPOR‑Y193F突变体蛋白晶体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)获得突变的LPOR‑Y193F cDNA序列设计LPOR cDNA Y193F突变引物，利用KOD Plus mutagenesis kit获得突变的LPOR‑Y193F cDNA序列为SEQ ID NO 1；其中LPOR cDNA Y193F突变引物为Y193FN 5’‑GCAAGGCCTTCAAAGACAGCATGCTCAGCAATATGCTG‑3’；SEQ IDNO 2；Y193FC 5’‑GTCTTTGGCGGCCTTGCCCGACTTGAAGGGCTTACCG‑3’；SEQ IDNO 3；(2)表达载体构建将得到的所述LPOR‑Y193F cDNA克隆到原核表达载体pE‑SUMO3中，得到pE‑SUMO3‑LPOR‑Y193F；(3)LPOR‑Y193F突变体蛋白表达将所述pE‑SUMO3‑LPOR‑Y193F转入大肠杆菌BL21细胞中，并于25‑37℃，培养3‑5小时，直到OD600达到0.8，加入诱导剂于25‑30℃，培养3‑6小时，得到菌体悬液；(4)LPOR‑Y193F突变体蛋白分离将步骤3得到的所述菌体悬液进行离心并弃上清液，将得到的菌体重悬于冰浴的溶液A中，得到悬浊液；将所述悬浊液进行均质后离心，得悬浊液上清液，并将所述悬浊液上清液经0.44um的滤膜过滤后，上样5‑ml HiTrap FF原油柱，利用溶液B按咪唑浓度梯度洗脱；(5)LPOR‑Y193F突变体蛋白纯化收集步骤(4)洗脱下来的蛋白峰，加入SENP2蛋白酶，切掉SUMO尾巴，然后利用溶液C进行透析；随后，蛋白上样5‑ml Hitrap Q HP柱，洗脱溶液为0.05–0.5MNaCl梯度洗脱液；回收蛋白峰，过Superdex 75分子筛柱子，得到LPOR‑Y193F突变体蛋白；(6)LPOR‑Y193F突变体蛋白结晶将(5)得到的所述LPOR‑Y193F突变体蛋白浓缩至26‑30mg/ml，随后浓缩蛋白在蛋白点晶池液中生长1周；挑取晶体在防冻保护液中浸泡5‑10s，随即放入液氮管中保存，得到所述LPOR‑Y193F突变体蛋白结晶。