[发明专利]一种表达乙酰肝素酶的嵌合抗原受体修饰的免疫细胞的制备方法及应用

摘要

本发明涉及肿瘤免疫治疗技术与基因工程改造技术领域，提供了一种表达乙酰肝素酶的嵌合抗原受体修饰的免疫细胞的制备方法，包括如下步骤：目标序列选取，构建含嵌合抗原受体的pCDH载体，将乙酰肝素酶HPSE的DNA表达序列克隆进含嵌合抗原受体的pCDH载体中，慢病毒的包装，表达乙酰肝素酶的嵌合抗原受体修饰的免疫细胞的制备。本发明还提供了上述表达乙酰肝素酶的嵌合抗原受体修饰的免疫细胞在实体瘤免疫治疗方向上的应用。本发明的优点在于：提供了一种表达乙酰肝素酶HPSE的嵌合抗原受体修饰的免疫细胞及其应用，其表达的HPSE可以提高免疫细胞在肿瘤微环境中的迁移能力，为实体瘤的治疗提供了新的思路和途径。

主权项

1.一种表达乙酰肝素酶的嵌合抗原受体修饰的免疫细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)目标序列选取：选取乙酰肝素酶HPSE的核苷酸序列作为目标序列，其DNA序列如SEQ ID NO:1所示；(2)构建含嵌合抗原受体的pCDH载体：构建以实体瘤特异性抗原为靶点的嵌合抗原受体结构，整个嵌合抗原受体结构由识别上述实体瘤特异性抗原分子的scFv片段、CD8跨膜区、4‑1BB/CD137片段、CD3ζ片段依次顺序连接组成；在上述嵌合抗原受体结构序列的两端加入酶切位点粘性末端，克隆进入pCDH载体中，得含嵌合抗原受体的pCDH载体；(3)将乙酰肝素酶HPSE的DNA表达序列克隆进含嵌合抗原受体的pCDH载体中：直接将乙酰肝素酶HPSE表达序列进行合成后，克隆进入含嵌合抗原受体的pCDH载体，接着对其进行酶切，随后转染DH5α大肠杆菌，进行载体扩增并通过酶切与PCR测序鉴定，最终获得含乙酰肝素酶HPSE DNA表达序列及嵌合抗原受体的pCDH载体；(4)慢病毒的包装：先培养293T细胞，再使用Opti‑MEM作为转染试剂，通过慢病毒包装体系中的质粒与步骤(3)得到的含乙酰肝素酶HPSE DNA表达序列及嵌合抗原受体的pCDH载体来共转染293T细胞；培养一段时间后，进行病毒的收集，并通过超速离心进行浓缩与纯化；(5)表达乙酰肝素酶的嵌合抗原受体修饰的免疫细胞的制备：在获取供者的抗凝外周血后，离心去除血浆，获取血细胞，再通过Ficoll试剂进行单个核细胞PBMC的分离后，再转移至CD3/CD28anti‑body负载预处理的培养瓶使用含有IL2的KBM581培养基进行培养；其中，在培养的第2‑4天，加入步骤(4)制得的慢病毒进行感染，即可获得目标所需的表达乙酰肝素酶的嵌合抗原受体修饰的免疫细胞。