[发明专利]双荧光素酶报告基因表达载体pFireRluc的制备方法及其应用

摘要

本发明涉及双荧光素酶报告基因表达载体pFireRluc的制备方法及其应用，可有效解决测试系统受到细胞活性以及两种不同的载体在转染过程中转染效率的影响问题，以pmirGLO载体为模板，以R1/R2为引物进行扩增获得Rluc序列片段，该序列两端加上SalI酶切位点，以Sal I单酶切pGL4.10载体，将Rluc序列片段插入pGL4.10载体中，构建重组的pFireRluc双荧光素酶报告基因载体，有效用于真核细胞表达鉴定和对双荧光素报告基因表达载体pFireRluc的活性检验中，实现双荧光素酶报告基因表达载体pFireRluc在真核细胞表达鉴定中和活性试验中的应用。本发明方法新颖独特，提高实验数据的可信度，减小细胞活性和转染效率对实验结果的影响，能够排除细胞活性和转染效率对实验结果的影响，提高检测结果的稳定性和可靠性。

主权项

1.一种双荧光素酶报告基因表达载体pFireRluc的制备方法，其特征在于，以pmirGLO载体为模板，以R1/R2为引物进行扩增获得Rluc序列片段，该序列两端加上SalI酶切位点，以Sal I单酶切pGL4.10载体，将Rluc序列片段插入pGL4.10载体中，构建重组的pFireRluc双荧光素酶报告基因载体，具体方法包括以下步骤：（1）、设计Rluc引物：根据pmirGLO质粒中的Rluc表达单元DNA序列设计引物R1、R2：（2）、PCR扩增：以pmirGLO载体为模板，以R1、R2为引物进行PCR扩增，获得Rluc表达单元；（3）、产物电泳：将PCR扩增产物与10×溴酚蓝加样缓冲液混合，进行琼脂糖凝胶电泳，用DNA Makrer2000判断扩增片段大小，用凝胶分析系统照相；（4）、对电泳质粒提取、纯化，方法是：在紫外光照射下，将含有目的基因片段的琼脂糖凝胶快速切下，计算凝胶块的重量；凝胶块中加入Buffer DE‑A，融化；加入一半体积的缓冲液Buffer DE‑B，混匀成混合液；将混合液装柱离心，弃滤液，反复4次，装入Eppendorf管洗脱DNA，离心，温浴，电泳，验证回收的目的片段长度，得Rluc PCR扩增产物；（5）、制备DH5α感受态细菌：用接种环挑取LB固体培养基上的单个DH5α菌落，将其接种于LB液体培养基中，振荡过夜，培养，将菌液移至聚丙烯管中，放置冰水混合物中培养，冷却，离心，回收细菌，重悬，离心，得重悬菌体；（6）、用T4 DNA连接酶将Rluc表达单元与pGEM‑T载体连接，获得重组载体pGEM‑T‑Rluc， pGEM‑T Rluc重组体转化入大肠杆菌DH5α；（7）、以T7和SP6为引物，PCR鉴定重组体pGEM‑T Rluc，阳性重组载体位于2526bp处。