[发明专利]尼古丁选择性降解菌的构建方法及其在废烟叶水提液中的应用

摘要

本发明公开了一种尼古丁选择性降解菌的构建方法及其在废烟叶水提液中的应用，以Pseudomonas sp.JY‑Q为原始菌株，通过该菌全基因组信息分析，确定以下五个目的基因，构建目的基因的敲除载体，利用热转法将敲除载体转化到大肠杆菌缺失菌株WM3064中，利用载体上的Kanamycin抗性基因，筛选出第一次交换的重组子；将该菌株过夜扩培后，利用载体上携带的反筛选标记SacB基因，发生第二次交换的重组子——即目的基因随整合入基因组的质粒载体脱落，以实现基因无缝敲除，直至敲除全部目的基因。本发明所得的菌株与野生型JY‑Q的表型差异，主要包括生长差异、尼古丁和葡萄糖降解差异。

主权项

1.尼古丁选择性降解菌的构建方法，以Pseudomonas sp.JY‑Q为原始菌株，包括下述步骤：1)通过该菌全基因组信息分析，确定以下五个目的基因：一个葡萄糖激酶基因AA098_22370和四个葡萄糖脱氢酶基因AA098_12490，AA098_22860，AA098_11910和AA098_05800；2)构建目的基因的敲除载体：设计待敲除目的基因上下游同源臂扩增引物，在上游同源臂的正向引物5’端加入EcoRⅠ酶切位点，在下游同源臂的反向引物5’端加入BamHⅠ酶切位点，以融合PCR扩增出目的基因的上下游同源臂后，利用一步克隆法技术在体外将其与酶切后的线性载体pK18mobSacB重组；3)利用热转法将敲除载体转化到大肠杆菌缺失菌株WM3064中，然后加入2,6‑二氨基庚二酸,以此为供体菌，假单胞菌JY‑Q为受体菌进行双亲本接合；之后，由于自杀质粒载体pK18mobSacB无法在假单胞菌中独立复制，其接合转化到宿主菌株后会插入到JY‑Q的基因组上；利用载体上的Kanamycin抗性基因，可筛选出第一次交换的重组子；4)将该菌株过夜扩培后，利用载体上携带的反筛选标记SacB基因，在反筛选平板，即15％蔗糖平板上，可将发生第二次交换的重组子——即目的基因随整合入基因组的质粒载体脱落，以实现基因无缝敲除；5)重复步骤2)至4)，直至敲除全部目的基因。