[发明专利]一种适用于免疫荧光分析的小麦根部细胞核提取方法

摘要

本发明公开了一种适用于免疫荧光分析的小麦根部细胞核提取方法，其步骤为：（1）小麦幼根的获取，（2）细胞核提取，（3）DAPI荧光染色法检测细胞核，（4）免疫荧光组织化学分析，（5）统计分析，本发明提供的细胞核提取方法可大大减少细胞核提取所需时间，延长细胞核内蛋白活性的保持，增加后续目的蛋白检测的准确性和成功率，降低细胞核悬液中杂质的浓度，减少杂质对免疫荧光实验的影响，增加细胞核悬液中细胞核的数量，便于后续进行相关的统计实验与分析。本发明提供的提取方法适用于制作细胞核悬浮液以便于进行后续的亚显微水平细胞学相关实验。

主权项

1.一种适用于免疫荧光分析的小麦根部细胞核提取方法，其步骤为：（1）小麦幼根的获取：将小麦种子消毒冲洗后在20‑25℃置于放有湿润滤纸的培养皿中避光发芽，出芽1天后将幼苗移至培养间生长，生长期间补浇2次营养液，待幼苗生长至第5天，取小麦幼根备用，所述的幼苗在培养间的培养条件为：18‑23℃，65‑75% 相对湿度、光照12‑14 h/d；所述的营养液为1/2 霍格兰氏营养液，其配方为：2 mM 硝酸钙，2.5 mM 硝酸钾，0.5 mM 硝酸铵，0.5 mM 磷酸二氢钾，1 mM 硫酸镁，2.5 μM 碘化钾，50.2 μM 硼酸，50 μM 硫酸锰，15 μM 硫酸锌，0.52 μM 钼酸钠，0.05 μM 硫酸铜，0.053 μM 氯化钴，25 μM乙二胺四乙酸一钠铁，每次添加20‑30 mL；（2）细胞核提取：取步骤（1）获得的小麦幼根0.5 g，将材料截取成4‑6 mm的根段，置于冰上培养皿中，加入1 mL MgSO4缓冲液，用双面刀片将材料在溶液中切成小碎块，之后通过过滤器将培养皿中的溶液转移至离心管中，4℃ 1500 r/min 离心8‑12 min，弃上清，沉淀加MgSO4缓冲液重悬，即得细胞核悬液；步骤（2）中所述的MgSO4缓冲液的组分为：10 mmol/L 硫酸镁，50 mmol/L 氯化钾，5 mmol/L 4‑羟乙基哌嗪乙磺酸，3 mmol/L二硫苏糖醇，体积比为0.25 % TritonX‑100，pH值7.4‑7.6，现配现用；步骤（2）中所述的过滤器由450目尼龙膜和灭菌后的1.5 mL离心管组成，其制作方法为将尼龙膜裁剪成直径2 cm的圆片后，折成漏洞状直接放入离心管中，三层滤膜处靠管壁；（3）DAPI荧光染色法检测细胞核：取20 μL步骤（2）所制得的细胞核悬液，滴于附有多聚赖氨酸的载玻片上，制成细胞核贴片，室温晾干后，在避光条件下，载玻片上滴20 μL的DAPI染液染色4‑6 min，去除染液后，用0.01mM，pH 7.2的PBS清洗5次，盖上盖玻片，直接置于荧光显微镜下观察并拍照；（4）免疫荧光组织化学分析：取出制好的细胞核贴片，在玻片上加50 μL质量体积比为3%的BSA溶液，盖上盖玻片，于37℃ 封闭1 h；揭去盖玻片，用0.01mM，pH 7.2的PBS溶液清洗3次，每次4‑6 min；在玻片上加入50 μL —抗，盖上盖玻片，于4℃ 孵育12 h；揭去盖玻片，用0.01mM，pH 7.2的PBS溶液清洗3次，每次4‑6 min；避光条件下，在玻片上加50μL带有FITC标记的二抗，盖上盖玻片，于37℃孵育1 h；揭去盖玻片，用0.01mM，pH 7.2的PBS溶液清洗3次，每次4‑6 min；之后再进行DAPI染色，荧光显微镜下检测信号，并拍照记录结果；（5）统计分析：选取5张图片，实验重复3次；细胞核直径、数量的数据统计利用软件Image J，3次测量取平均值；相关统计数据利用GraphPad Prism 7.00进行双尾T检验分析，P < 0.05说明存在显著性差异。