[发明专利]一种基于信号放大检测HCV病毒载量的方法

摘要

本发明属于病毒诊断技术领域，特别涉及一种基于信号放大检测HCV病毒载量的方法，分别设计HCV病毒型别中HCV1b、HCV2a、HCV3a、HCV3b、HCV6b5种型别的特异性引物，检测样品、通用捕获引物和裂解液混合裂解，再加入检测探针缓冲液进行杂交，经放大分子溶液放大后依次加探针标记物和底物，完成捕获杂交后的信号放大，最后用化学发光检测信号获得样品中HCV病毒载量。本发明的敏感性在200‑300个HCV病毒拷贝才能检测到，对于临床患者的病毒载量的监测其敏感性是足够的，可有效避免测定结果假阳性的基础上，简便、快速地实现对样品中HCV‑RNA准确定量。

主权项

1.一种基于信号放大检测HCV病毒载量的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1，准备待检测样品，所述待检测样品为血清、血浆、全血中的其中一种；S2，针对HCV病毒型别设计特异性引物，每个HCV病毒型别的特异性引物数量≥8条；S3，将浓度为1pmol/ul的通用捕获引物溶液包被在孔微板中，在避光密闭条件下冷藏24h，然后再恢复到室温，待用，所述通用捕获引物的序列如SEQ ID NO.54所示；S4，向S3的孔微板中加入S1中检测样品和裂解液，其中S1中检测样品、S3中通用捕获引物溶液、裂解液体积比为1:2:2，65℃裂解1h，得裂解样品；其中，裂解液由以下质量浓度的组分组成：10％的EDTA、2.53％的Hepes、1.79％的Tris、15％的十二烷基硫酸锂，余量为去离子水；S5，向裂解样品加入相当于S1中检测样品2倍体积量的检测探针缓冲液，55℃杂交3～5h，得杂交样品；其中，所述检测探针缓冲液由S2中特异性引物混合物、所述裂解液、蛋白酶K溶液以1:50:49的体积比组成；S6，用洗液洗含有S5的微孔板，然后加入相当于S1中检测样品2倍体积量的放大分子溶液，55℃温育35min，得初步放大溶液；S7，用洗液洗含有S6的微孔板，然后加入相当于S1中检测样品2倍体积量的放大分子溶液，55℃温育35min，得放大溶液；S8，用洗液洗含有S7的微孔板，加入相当于S1中检测样品2倍体积量的探针标记溶液，50℃温育35min，得标记溶液；其中，探针标记溶液由以下质量浓度的组分组成：0.05％标记探针、3.75％Hepes、5.3％Tris、7.5％MgCl2、0.5％ZnCl2、余量为去离子水，所述标记探针的序列如SEQ ID NO.56所示；S9，用洗液洗含有S8的微孔板，然后加入S1中检测样品2倍体积量的底物溶液，30℃温育15min，得到待检测溶液；其中，底物溶液由以下质量浓度的组分组成：1.5％的CDP‑Star、余量为增强剂组成；S10，将S9中待检测溶液置于化学发光分析仪上读数，再对照标准曲线计算得检测样品中HCV病毒载量。