[发明专利]一种基于荧光定量系统的LAMP定量方法

摘要

本发明公开了一种基于荧光定量系统的LAMP定量方法，该方法利用荧光定量PCR仪就能实现LAMP定量，将LAMP技术与荧光定量技术结合，建立了一种基于荧光定量系统的LAMP定量方法，该方法可以达到定量的目的，同时操作简单、灵敏度高、重复性好，使LAMP检测更加精准便捷。为实现LAMP精准定量开拓了一个新方向。

主权项

1.一种基于荧光定量系统的LAMP定量方法，该方法利用荧光定量PCR仪实现LAMP定量，采用2种常用荧光染料测试LAMP反应，并对染料浓度进行筛选确定，具体包括以下内容：Evagreen染料浓度的优化，该染料低浓度对PCR及LAMP抑制作用较小，优化浓度梯度为：0.2X, 0.6X, 1.0X, 1.4X, 1.8X, 2.2X；SYTO‑82染料浓度的优化，SYTO‑82是一种稳定性高，信噪比低的荧光染料，低浓度对PCR及LAMP抑制作用较小，优化浓度梯度为：45μM, 35μM, 25μM, 15μM, 5μM, 2.5μM；本发明建立的LAMP定量体系为：总体积20μL，包括：1x Thermopol buffer (20 mM Tris‑HCl，(pH8.8)，10 mM KCl，10 mM (NH4)2SO4，2 mM MgSO4，0.1%.Triton X‑100)，6 mM MgSO4，1.4 mM dNTPs，0.8 M 甜菜碱，0.2μM外引物（tcdA‑F3,tcdA‑B3），1.6μM 内引物（tcdA‑FIP,tcdA‑BIP），0.8μM环引物（tcdA‑LB），320 U/mL Bst DNA 聚合酶，0.2X‑2.2X Evagreen 或2.5‑45μM SYTO‑82，模板DNA 1μL，ddH2O补足至20μL；LAMP荧光定量检测程序为：63℃ 15s； 63℃ 30s，63℃ 30s，60个循环；95℃ 2min；25℃，2min。