[发明专利]转CmWRKY15-1基因切花菊的培育、鉴定及应用

摘要

本发明属于植物基因工程及分子植物育种领域，提供包括有CmWRKY15‑1基因的重组载体、转化细胞、转CmWRKY15‑1基因切花菊的培育、鉴定方法及应用。转CmWRKY15‑1基因切花菊的培育方法包括如下步骤：（1）菊花CmWRKY15‑1基因的克隆（2）植物表达载体PBI121‑CmWRKY15‑1的构建（3）农杆菌EHA105介导叶盘法转化菊花。对转化植株进行PCR、定量RT‑PCR检测证实CmWRKY15‑1基因已整合到转基因植株基因组DNA中并发生转录。对转基因植株进行抗病性检测，转基因植株抗白色锈病能力明显提高，为选育抗病新品种菊花提供切实可行的方法。

主权项

1.一种转CmWRKY15‑1基因切花菊的培育方法，其特征在于：以菊花白色锈病高抗品种‘双粉匙’为材料获得抗病基因CmWRKY15‑1，通过酶切连接与植物表达载体PBI121质粒进行重组连接，通过农杆菌介导法将CmWRKY15‑1基因导入菊花，所述培育方法应用于抗白色锈病转基因菊花株系的培育；转CmWRKY15‑1基因切花菊的培育方法包括如下步骤：（1）菊花CmWRKY15‑1基因的克隆以抗病品种‘双粉匙’叶片为材料，提取RNA并反转录成cDNA，根据转录组测序所得到的序列信息设计特异引物：上游引物CmWRKY15‑1‑F：序列如SEQ ID NO.2所示下游引物CmWRKY15‑1‑R：序列如SEQ ID NO.3所示；获得CmWRKY15‑1基因序列，序列如SEQ ID NO.1所示；结合PCR扩增目的基因的全长序列，设计引物：上游引物CmWRKY15‑1‑2F：序列如SEQ ID NO.4所示；下游引物CmWRKY15‑1‑2R：序列如SEQ ID NO.5所示；在CmWRKY15‑1基因的上游和下游分别引入Xba I和Sac I酶切位点获得PCR产物；（2）植物表达载体PBI121‑CmWRKY15‑1的构建将步骤（1）获得的PCR产物连接到pTOPO‑T载体上，转化DH5α感受态细胞，提取阳性质粒；用限制性内切酶Xba I和Sac I分别对提取的质粒及PBI121载体进行双酶切，PCR电泳检测回收酶切产物，然后用T4连接酶连接过夜，连接产物转化DH5α大肠杆菌，提取阳性质粒进行双酶切验证；（3）农杆菌EHA105介导叶盘法转化菊花将步骤（2）制备的阳性质粒PBI121‑CmWRKY15‑1转化农杆菌感受态EHA105，获得阳性克隆农杆菌，通过叶盘法转化菊花，将CmWRKY15‑1基因转入菊花中，获得转CmWRKY15‑1基因切花菊；（4）鉴定该鉴定方法将转CmWRKY15‑1基因初步获得的抗性植株进行PCR鉴定、荧光定量RT‑PCR分子检测，筛选阳性植株，获得转基因菊花株系；具体包括如下步骤：（1）PCR检测提取生根筛选得到的卡那霉素抗性待检测植株基因组DNA，将筛选基因NPTⅡ作为检测目标，根据NPTⅡ基因两端合成扩增反应引物，扩增出的片段长为676bp，引物序列为：上游引物PBI121‑NPTⅡ‑F：序列如SEQ ID NO.6所示，下游引物PBI121‑NPTⅡ‑R：序列如SEQ ID NO.7所示；分别以卡那霉素抗性植株和未转化植株DNA为模板，以PBI121‑NPTⅡ‑F和PBI121‑NPTⅡ‑R为引物，进行PCR检测，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测分析；（2）荧光定量RT‑PCR检测提取抗卡那霉素植株叶片及野生型植株叶片总RNA，反转录合成cDNA第一链，建立荧光定量RT‑PCR扩增体系，每个样品重复3次，根据数据分析得到各个样品的CT值，以野生型植株的表达为基准值，计算各转基因植株及野生型基因相对表达情况；特异引物扩增出的片段长度为131bp阳性结果，引物序列：上游引物CmWRKY15‑1‑RT‑F：序列如SEQ ID NO.8所示，下游引物CmWRKY15‑1‑RT‑R：序列如SEQ ID NO.9所示；以Actin扩增的基因片段为内参，片段长度为188bp阳性结果，引物序列：上游引物Actin‑F：序列如SEQ ID NO.10所示，下游引物Actin‑R：序列如SEQ ID NO.11所示；由PCR、荧光定量RT‑PCR检测呈阳性，确定获得转基因菊花株系。