[发明专利]一种检测血液中氯硝西泮含量的液相色谱分析方法

摘要

本发明检测血液中氯硝西泮药物浓度的方法是使用液相色谱分析仪器和紫外检测器对标准溶液进行标定，拟合得到标准曲线方程为y＝a*x+b，取待测血液样品，在该待检测血液经过处理后，同样使用液相色谱分析仪器和紫外检测器对待测的样品进行检测，得到待测血液y值，将待测血液y代入标准曲线方程中，通过计算得到待测血液样品中目标物相对浓度x，内标物工作液浓度是已知的，由此计算得到该样本中待检测血液中的氯硝西泮药物浓度，该方法具有快速、提取率高、重现性好、专属性好、分离效率高和定量分析准确的优点，可满足抗癫痫药物氯硝西泮血药浓度监测的要求，为临床氯硝西泮的个性化给药提供依据。

主权项

1.一种检测血液中氯硝西泮药物浓度的方法，其特征在于：它包括以下步骤：(一)标准溶液的标定首先将至少三种不同浓度的标准工作液10μL分别和10μL内标工作液及由1∶1的甲醇和水组成的80μL复溶液混合制成至少三种标准溶液，上述标准溶液分别在转速为1200‑2000rpm下涡旋混匀1‑5min后，使用液相色谱分析仪器和紫外检测器对上述标准溶液进行检测，得出上述至少三种标准溶液的氯硝西泮和内标色谱图，在上述氯硝西泮和内标色谱图中分别得到标准目标物峰面积与内标物峰面积，以上述至少三个标准目标物峰面积与内标物峰面积的比值作为标准曲线图的纵坐标y，以上述标准工作液浓度与内标工作液浓度的比值即相对浓度为作为标准曲线图的横坐标x，将以上检测所得至少三组数据进行线性回归，拟合得到标准曲线方程为y＝a*x+b，并且得出权重系数a和b；所述标准工作液为氯硝西泮溶液，所述内标工作液为硝西泮溶液；(a)标准工作液的配制：精确称取氯硝西泮标准品10mg置于10ml容量瓶，用含水量为0％‑25％的甲醇溶液进行溶解，并定容于10ml，得到标准储备液A，将标准储备液A用含水量为25％‑60％的甲醇溶液的稀释液进行稀释，分别在含有200ng/mL‑2000ng/mL氯硝西泮的范围内配置出各标准工作液，并在‑80℃条件下保存；(b)内标工作液的配制：精确称取硝西泮标准品10mg置于10mL容量瓶，用含水量为0％‑25％甲醇溶解，并定容于10mL，得到标准储备液B，将标准储备液B用含水量为25％‑60％的甲醇溶液的稀释液进行稀释，得到浓度为650ng/mL的内标工作液，并在‑20℃条件下保存；(二)检测血液的离心取待检测血液至少5ml，在离心速度为3500rpm下离心10min，取上清液得血清或血浆，上述血清或血浆置于‑20℃冷冻下保存至分析前备用；(三)待测样品处理(c)用移液枪移取10μL步骤(b)中所述内标工作液于1.5ml离心管中，然后加入200μL步骤(二)中所述血清或血浆，在1200‑2000rpm的转速下涡旋震荡混合20s‑1min；(d)用移液枪移取1.25mL由1∶2‑4的二氯甲烷与乙酸乙酯组成的萃取剂加入步骤(c)的离心管中，在1200‑2000rpm的转速下涡旋震荡混合4‑6min，再在10000‑15000rpm的转速下高速离心8‑12min，得到上清液；(e)取步骤(d)上清液1mL放入另一支1.5ml离心管中，在常温下用N2缓慢吹干；(f)向步骤(e)的上述吹干的离心管中加入由1∶1的甲醇和水组成的复溶液100μL，然后在1200‑2000rpm转速下涡旋混匀30s‑1min后，再在10000‑15000rpm的转速下高速离心2‑4min，得到上清液即为待测样品；(四)待测样品的检测使用液相色谱分析仪器和紫外检测器对上述步骤(f)待测的样品进行检测，得出上述待测的样品的氯硝西泮和内标色谱图，在上述氯硝西泮和内标色谱图中得到待测目标物峰面积与内标物峰面积，将待测目标物峰面积与内标物峰面积的比值y代入上述步骤(一)的标准曲线方程中，通过计算得到待检测样品中目标物相对浓度x，内标物工作液浓度是已知的，由此计算得到该样本中待检测血液中的氯硝西泮药物浓度。