[发明专利]一种永生化树鼩小肠上皮细胞系及其构建方法与应用

摘要

本发明涉及一种永生化树鼩小肠上皮细胞系及其构建方法与应用，属于细胞技术领域。本发明通过用慢病毒介导hTERT基因转染获得的细胞系，激活了树鼩肠上皮细胞的端粒酶活性，能够迅速、有效的建立永生化的树鼩肠上皮细胞，所建立的永生化树鼩肠上皮细胞成功越过了复制衰老，获得了永生性，并且该永生化树鼩肠上皮细胞保持了与原代树鼩肠上皮细胞十分相近的表型，保持了细胞接触抑制和细胞增殖的密度限制，用呼肠孤病毒感染以后能够出现CPE，所以能够用于病毒感染等研究。

主权项

1.一种永生化树鼩小肠上皮细胞系的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤（1），慢病毒转染前18‑24小时，将树鼩原代肠上皮细胞以1×104/孔铺到细胞培养板中培养，并使细胞在慢病毒转染时的数量为2×104/孔；其中，培养所采用的培养基为完全培养基；所述的完全培养基为DMEM高糖培养基添加2‑5%（v/v）胎牛血清，1%双抗，1%ITS‑G，1%HEPES和10ng/ml重组人表皮生长因子；步骤（2），吸去细胞原有培养基，每孔加入250μL维持液，按照MOI=2~100换算病毒原液体积，并按体积将病毒原液加入细胞中，摇匀，置于37℃培养箱感染4小时；之后再每孔加入250μL维持液继续培养12小时；吸去培养液，换上新鲜的完全培养基，每孔500μL，继续培养≥72小时，作为实验组；同时，对照组，对照组与上述实验组的区别在于不加入病毒原液，其余都相同；所述的维持液为DMEM高糖培养基添加1%双抗、1%ITS‑G、1%HEPES和10ng/ml重组人表皮生长因子；所述的病毒原液的制备方法为：采用RT‑PCR扩增hTERT基因序列，之后对慢病毒表达载体pHBLV‑CMVIE‑ZsGreen‑Puro进行双酶切，然后通过T4连接酶对扩增产物和双酶切后慢病毒表达载体通过T4连接酶进行连接，得到重组质粒；将得到的重组质粒与pSPAX2、pMD2G质粒采用脂质体的方法共转染293T细胞中，制得慢病毒；对制得的慢病毒进行滴度检测，得到病毒原液所述的hTERT基因序列如SEQ ID NO.1所示；步骤（3），往实验组和对照组中分别加入嘌呤霉素至终浓度为2~10μg/mL，待对照组的细胞被嘌呤霉素杀光，将实验组的嘌呤霉素浓度减半继续培养，细胞汇合至70%‑90%时，进行传代培养，三代内继续用含浓度减半的嘌呤霉素的完全培养基培养细胞，之后采用完全培养基继续传代培养，即得到永生化树鼩小肠上皮细胞系。