[发明专利]一种基于阻断uPA-uPAR相互作用的药物活性成分筛选和垂钓方法

摘要

本发明公开了一种基于阻断uPA‑uPAR相互作用的药物活性成分筛选和垂钓方法，包括：构建FITC标记的uPA探针、构建诱导表达uPAR的酵母表面展示细胞系KM71‑uPAR、构建竞争性抑制uPA‑uPAR结合的中药混合物筛选体系、构建从中药混合物中垂钓靶向uPAR的药物先导化合物体系，采用垂钓的方法进一步分离先导化合物的方法，该方法具有高灵敏度，高通量的特点，并且针对中药混合物中的微量成分能够大量垂钓获得，能一步到位的在受体水平上筛选获得分子作用靶点明确的药物先导化合物。

主权项

1.一种基于阻断uPA‑uPAR相互作用的药物活性成分筛选和垂钓方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1 构建FITC标记的uPA探针：A.采用FITC Fast Conjugation试剂盒，将FITC偶联到人uPA蛋白上，从而得到FITC标记的uPA配体探针（uPA‑FITC）；B.用标记的uPA‑FITC探针与uPAR高表达或缺失细胞系孵育，荧光显微镜检测FITC标记后uPA的生物活性、特异性；步骤2 构建诱导表达uPAR的酵母表面展示细胞系KM71‑uPAR：A.将人uPAR的cDNA连接到质粒pPICZaA‑Flo1p，得到重组质粒pPICZaA‑Flo1p‑uPAR；B.将重组质粒通过电击转化导入到毕赤酵母KM71中，筛选阳性克隆菌株；C.优化重组酵母诱导表达条件，以uPA‑FITC为探针检测uPAR在酵母表面的表达，用荧光显微镜监测荧光探针的定位；步骤3 构建竞争性抑制uPA‑uPAR结合的中药混合物筛选体系：优化酵母细胞数量与uPA‑FITC荧光探针的比例，加入阳性阻断剂，用生理盐水洗脱未结合的探针，荧光分光光度计检测，得到不同阻断剂加入量与荧光强度变化曲线；步骤4 构建从中药混合物中垂钓靶向uPAR的药物先导化合物体系：A.将能够竞争性阻断uPA‑uPAR结合的中药混合物与表面展示uPAR的酵母菌共同孵育，通过离心、洗涤去除未结合物质，解离释放出高亲和力单体成分或成分组；B.对于具有高亲和力的成分组，重复进行步骤3中竞争性抑制活性进行验证，获得高活性的成分。