[发明专利]牛乳酪蛋白3种主要组分同时分离的方法

摘要

本发明公开了一种牛乳酪蛋白3种主要组分同时分离制备的方法，旨在提供一种以牛乳酪蛋白为原料，以DEAE离子交换柱为分离设备，通过一次分离同时获得α‑酪蛋白、β‑酪蛋白和κ‑酪蛋白，即酪蛋白3种主要单体组分的分离方法；本发明只需一步分离即可获得3种酪蛋白单体组分，分离步骤少，分离工艺简单易操作，分离条件温和易实现，分离设备简易，分离过程中化学试剂用量少，既降低了酪蛋白单体分离成本，又降低了环境污染，符合低碳环保新理念；通过本发明分离酪蛋白单体平均得率高，其中α‑酪蛋白平均得率可达75%以上，β‑酪蛋白平均得率可达80%以上，κ‑酪蛋白平均得率可达85%以上；通过本发明所获酪蛋白单体纯度高，3种单体纯度均可达到95%以上；该方法既能满足实验室制备3种高纯度酪蛋白单体组分的需求，也可用于工业化制备酪蛋白主要单体，应用范围广泛。

主权项

牛乳酪蛋白3种主要组分同时分离的方法，以牛乳酪蛋白为原料，其特征在于，α‑酪蛋白、β‑酪蛋白和κ‑酪蛋白由下述方法实现一次分离制备而成：步骤1：将酪蛋白按1:20~1:50的料液质量比溶于含有3.3mol/L的尿素、pH为8.5的三羟甲基氨基甲烷盐酸水溶液中，并加入0.2%（体积比）β‑巯基乙醇，搅拌至其充分溶解，得到酪蛋白溶液；步骤2：按照酪蛋白与树脂的质量比为1:40～1:70的比例称取DEAE离子交换树脂，用蒸馏水冲洗，去除杂质；加入0.5mol/L NaOH浸泡2h，用蒸馏水洗至中性；再加入0.5mol/L HCl浸泡2h，用蒸馏水洗至中性，备用；步骤3：将处理后的离子交换树脂倒入层析柱中，使其缓慢沉降；用蠕动泵将pH8.5的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液（含3.3mol/L尿素）以1～1.5mL/min的流速输送至层析柱顶端，直至流出液的pH值与平衡缓冲液的pH值一致时，层析柱达到平衡；步骤4：将酪蛋白溶液采用蠕动泵以0.2～0.5mL/min流速输送至层析柱上端；步骤5：洗脱剂A液为20mmol/L的三羟甲基氨基甲烷盐酸水溶液（含3.3mol/L的尿素），B液为20mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐水溶液（含3.3mol/L的尿素，0.3mol/L的NaCl）；采用蠕动泵以1.8mL/min的流速输送洗脱剂A，以0.2mL/min的流速输送洗脱液B，每隔30～35min将B液流速增加0.1mL/min，同时将A液流速降低0.1mL/min，即确保总流速和单位时间洗脱液量不变，直至B液终含量为100%，历时约540～630min；洗脱过程中采用自动收集器收集洗脱液，每5mL洗脱液收集至同一样品瓶；采用紫外可见分光光度计在280nm波长下测定样品瓶洗脱液的吸光度值，以吸光度值为纵坐标，以洗脱液体积为横坐标作图，得到酪蛋白单体组分分离曲线；步骤6：采用标准品通过液相色谱鉴定得知，步骤5中所得分离曲线中第2、3个峰为κ‑酪蛋白，第4、5、6个峰为β‑酪蛋白，第7、8、9个峰为α‑酪蛋白；按照上述峰对应的洗脱液体积合并对应的洗脱液，分别冷冻干燥得酪蛋白3种主要单体组分，冷冻干燥的温度为‑50℃，压强为500~600Pa，时间为24h，使用钢制托盘进行冷冻干燥。