[发明专利]一种吸附无细胞百白破和B型嗜血流感四价联合疫苗的制备方法

摘要

本发明公开了一种吸附无细胞百白破和B型嗜血流感四价联合疫苗的制备方法，包括步骤S1，菌种库的建立百日咳菌种库的建立、白喉棒状杆菌菌种库的建立、破伤风芽孢杆菌菌种库的建立和B型嗜血流感杆菌菌种库的建立；S2，百日咳原液的制备硫酸铵盐析、密度梯度离心和戊二醛脱毒；S3，白喉类毒素制备；S4，破伤风类毒素制备；S4，B型嗜血流感毒素制备；S5，四价联合疫苗的配置。本发明为将百日咳原液、白喉类毒素、破伤风毒素和B型嗜血流感毒素混合制成四价联合疫苗，能够有效防治百日咳、白喉、破伤风和B型流感；采用水油乳剂MF59和PLG微粒替代氢氧化铝佐剂，能够有避免DTaP‑Hib的PRP多糖免疫反应降低的现象，提高DTaP‑Hib四联疫苗的可靠性和安全性。

主权项

一种吸附无细胞百白破和B型嗜血流感四价联合疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤，S1，菌种库的建立百日咳菌种库的建立：将百日咳菌种接种于包‑姜氏培养基上，于35～37℃培养不超过72小时，以后各代不超过48小时，传至第4代，培养24小时，刮下菌苔，于脱脂牛奶内混匀，分装后冷冻干燥，真空封口，‑20℃保存，为主代种子批菌种；白喉棒状杆菌菌种库的建立：将白喉棒状杆菌菌种接种于林氏培养基上，于34℃培养24～48小时，再传代于林氏培养基上，连续传4代，离心后将菌体放置于脱脂牛奶内混匀，分装后冷冻干燥，真空封口，‑20℃保存，为主代种子批菌种；破伤风芽孢杆菌菌种库的建立：将破伤风厌氧芽孢杆菌菌株接种于半固体碎肉培养基中管，放置于34℃孵箱内培养48小时，连续传4代，离心后将菌体放置于脱脂牛奶内混匀，分装后冷冻干燥，真空封口，‑20℃保存，为主代种子批菌种；B型嗜血流感杆菌菌种库的建立：将B型嗜血流感杆菌菌种接种于PH7.4的包‑姜氏培养基上，于35～37℃培养24～48小时，连续传4代，离心后将菌体放置于脱脂牛奶内混匀，分装后冷冻干燥，真空封口，‑20℃保存，为主代种子批菌种；S2，百日咳原液的制备硫酸铵盐析：将百日咳主代种子批菌种稀释至浓度为40Lf/ml，加入硫酸铵溶液进行一次盐析、7日后经3500rPm离心40分钟，弃上清，沉淀中加入PBS进行一次浸提，每天搅拌2次，每次40分钟；经7000rPm离心60分钟弃沉淀、上清液中加高浓度的硫酸铵二次盐析、经9000rPm离心60分钟，收集沉淀加入PBS二次浸提3天，每天搅拌2次，每次1小时，包袋透析，铵根检测合格后，透析内液经16000rPm离心3小时收上清；密度梯度离心：经30000rpm蔗糖密度梯度离心18～20小时除去内毒素，收集糖浓度为4％～12％之间的样品，其中含有PT和FHA组分；戊二醛脱毒：将梯度离心后的中间品用PBS稀释为50μgPN/ml，然后加入戊二醛使之最终戊二醛浓度为0.5％，置于20℃脱毒，每1小时振摇一次，然后加入赖氨酸溶液，使之最终浓度为0.2％，置于20℃作用3小时；S3，白喉类毒素制备将白喉棒状杆菌主代种子批菌种稀释至浓度为40Lf/ml，加入浓度为0.5％的甲醛和9.125％的赖氨酸，pH调至7.0～7.2，在37～39℃下脱毒42天；S4，破伤风类毒素制备将破伤风厌氧芽孢杆菌主代种子批菌种稀释至浓度为40Lf/ml，加入浓度为0.5％的甲醛，加入的甲醛量为0.15％，放置于37℃温箱中加温脱毒25天；S4，B型嗜血流感毒素制备将B型嗜血流感杆菌主代种子批菌种稀释至浓度为40Lf/ml，加入浓度为0.5％的甲醛和9.125％的赖氨酸，pH调至7.0～7.2，放置于37℃温箱中加温脱毒25天；S5，四价联合疫苗的配置将百日咳原液、白喉类毒素、破伤风毒素、水油乳剂MF59和PLG微粒混合配置成百白破疫苗，再将B型嗜血流感毒素与百白破疫苗混合制得四价联合疫苗。