[发明专利]一种通路克隆入门载体的构建方法

摘要

本发明涉及一种通路克隆入门载体的构建方法，包括引物设计、ICS1pro片段的扩增与纯化、pCR8片段的获得和pCR8‑ICS1pro质粒的构建。本发明利用通路克隆入门载体pCR8‑AtS5H来获得入门载体片段，而且该入门克隆可以保存和反复使用，因此实验过程中不需要购买昂贵的入门载体，同时该方法所用的其它试剂成本也非常低，从而大大降低了构建入门克隆的实验成本，并且非常省时，两天内即可完成入门克隆的构建和验证；本发明利用的一步SLIC技术是一种不依赖序列和连接的克隆方法，连接效率非常高，同时不受酶切位点限制，也不存在TA连接的非定向克隆问题，是一种非常值得推广的构建入门克隆的新方法。

主权项

一种通路克隆入门载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)引物设计根据pCR8载体和水稻异分支酸合成酶基因的启动子序列设计基因扩增引物ICS1pro‑F1和ICS1pro‑R1，根据水稻异分支酸合成酶基因的启动子序列设计菌落PCR引物ICS1pro‑F2和ICS1pro‑R2；(2)ICS1pro片段的扩增与纯化以CTAB方法提取的日本晴DNA为模板进行PCR基因扩增，然后进行琼脂糖凝胶电泳，切胶并利用胶回收试剂盒纯化回收PCR产物，即得ICS1pro片段；(3)pCR8片段的获得采用通路克隆入门载体pCR8‑AtS5H作为原始载体，利用限制性内切酶EcoRI对其进行单酶切，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，并利用胶回收试剂盒对割胶产物进行回收，得到pCR8片段；(4)pCR8‑ICS1pro质粒的构建利用一步SLIC法将回收的ICS1pro片段和pCR8片段进行连接，其中ICS1pro片段和pCR8片段的摩尔比为2:1，26℃金属浴孵育2.5min，然后立即置于冰中10min，取反应产物转化大肠杆菌DH5α感受态，采用菌落PCR验证和测序进行鉴定，从而最终得到阳性入门克隆载体pCR8‑ICS1pro；步骤(1)中，所述水稻采用日本晴。