[发明专利]一种dead SaCas9-Fok1系统及其构建方法与应用

摘要

本发明公开了一种dead SaCas9‑Fok1系统及其构建方法与应用，由于SaCas9分子量小，p‑dead SaCas9‑Fok1重组质粒利用dead SaCas9替代传统的dead SpCas9，降低SpCas9空间位阻对Fok1相互结合的影响，从而提高其打靶效率；dead SaCas9‑Fok1系统需要配合2个21nt的Sa‑sgRNA共同作用，Sa‑sgRNA长于Sp‑sgRNA(20nt)，且SaCas9识别的PAM序列为6nt，长于SpCas9的PAM(3nt)，所以当dead SaCas9‑Fok1配合两个Sa‑sgRNA使用，进一步降低了脱靶效率。

主权项

一种dead SaCas9‑ Fok1系统，其特征在于，包括dead SaCas9‑ Fok1和第一sgRNA和第二sgRNA；所述dead SaCas9‑ Fok1是在dead SaCas9的C端融合Fok1内切酶而得到，所述dead SaCas9是将SaCas9中的两个活性位点RuvC和HNH失活后而得到的；所述第一sgRNA识别并结合的靶序列位于目的基因的一条链上，所述第二sgRNA识别并结合的靶序列位于目的基因的另一条链上；所述dead SaCas9‑ Fok1能够分别与第一sgRNA和第二sgRNA组成复合体，当所述第一sgRNA与dead SaCas9‑ Fok1组成的复合体和第二sgRNA与dead SaCas9‑ Fok1组成的复合体结合到各自靶序列并相互识别时，所述第一sgRNA与dead SaCas9‑ Fok1复合体中的Fok1与所述第二sgRNA与dead SaCas9‑ Fok1复合体中的Fok1能够相互结合，使得Fok1内切酶活性被激活。