[发明专利]一种抗松材线虫病马尾松体细胞胚胎发生和植株再生方法

摘要

本发明公开了一种抗松材线虫病马尾松体细胞胚胎发生和植株再生方法，以抗松材线虫病马尾松未成熟合子胚为材料，经胚性愈伤组织诱导、胚性愈伤组织的增殖与维持、分化成熟以及萌发，并对体细胞胚进行生根诱导、再生植株进行壮苗培养以及驯化移栽，最终获得抗松材线虫病马尾松植株。本发明的抗松材线虫病马尾松体细胞胚胎发生和植株再生方法，以抗性马尾松未成熟合子胚为材料，初步建立了抗性马尾松体细胞胚胎发生再生体系，对抗性马尾松胚性愈伤组织诱导进行优化，进一步研究了体细胞胚增殖、分化、萌发、再生植株移栽驯化等重要环节，培育出小批量的抗病马尾松悬浮培养及体细胞胚胎发生再生植株，为抗性马尾松的工厂化生产奠定了良好的技术基础。

主权项

一种抗松材线虫病马尾松体细胞胚胎发生和植株再生方法，其特征在于，包括以下步骤：1）在6‑8月间采集抗性马尾松未成熟的球果，采集当天即放在4℃冰箱保存备用；对马尾松种子消毒，剥取获得无菌雌配子体为外植体进行愈伤组织诱导；2）以LP、DCR为基本培养基，培养基均附加麦芽糖30g/L，肌醇1g/L，谷氨酰胺450mg/L，酸水解酪蛋白500mg/L，MES 250mg/L，琼脂粉6.24g/L；对步骤1）的外植体进行愈伤组织诱导，诱导培养1～2月；3）将诱导的胚性愈伤组织转接到增殖培养基中，分别采用液体悬浮培养和固体培养两种增殖方式进行继代培养；以LP为基本培养基，添加2,4‑D 1mg/L、6‑BA 0.5mg/L、琼脂粉6.24g/L；4）将增殖后的胚性愈伤组织转接入以LP为基本培养基，附加2 mg/L ABA，1 mg/L GA3，130g/L PEG8000，25g/L麦芽糖，1g/L活性炭，3.5g/L凝胶，进行成熟培养；再将质量较好的体细胞胚转接到萌发培养基中，进行萌发培养；萌发培养基以1/2 LP为基本培养基，附加20g/L麦芽糖，2g/L活性炭，8g/L琼脂；5）将萌发后的体胚苗转接到装有壮苗生根培养基的培养瓶中，促使体胚苗的根叶进一步分化；壮苗生根培养基配方为1 mg/L IBA+0.2 mg/L NAA；6）选取健壮的体胚苗进行驯化，采用半开瓶+全开瓶的方式炼苗；将驯化后的再生植株，移栽于林下土与草碳土2:1混合的基质中。