[发明专利]一种利用微量神经组织获取和培养少突胶质前体细胞的方法

摘要

本发明属于生物医学领域，涉及少突胶质前体细胞的获取方法，具体涉及一种从新生大鼠微量神经组织获取少突胶质前体细胞并纯化培养的方法。本方法通过将微量神经组织用消化酶Accusase进行适度消化并结合机械吹打，离解成单细胞悬液，种植在多聚赖氨酸包被的培养底面上，添加无血清培养基进行贴壁培养，促使少突胶质前体细胞大量增殖，同时抑制非少突胶质前体细胞过快增殖。培养10天后，撤除培养基中B27添加剂2～3天，使少突胶质前体细胞粘附力暂时降低，通过机械吹打方式进行选择性分离，获得进一步纯化的大鼠少突胶质前体细胞。获得的少突胶质前体细胞具有连续增殖能力，能够连续传代，并具有分化为成熟少突胶质细胞的能力。

主权项

1.一种从新生大鼠微量神经组织获取少突胶质前体细胞并纯化培养的方法，其特征在于，将微量神经组织如视神经及海马等用消化酶Accusase进行适度消化并结合机械吹打，离解成单细胞悬液后，种植在多聚赖氨酸包被的培养底面上，添加含有PDGF的无血清培养基进行贴壁培养，特异性地促使少突胶质前体细胞大量增殖，相对抑制非少突胶质前体细胞的增殖；培养10天后获得富含少突胶质前体细胞克隆的原代细胞；随后暂时撤除培养基中B27添加剂2～3天，利用贴壁少突胶质前体细胞突起暂时回缩、粘附力明显降低的时机，结合人工机械分离方法，获得高纯度的少突胶质前体细胞；获得的大鼠少突胶质前体细胞具有连续增殖能力，能够连续传代，并具有有分化为成熟少突胶质细胞的能力；包括步骤：(1)新生大鼠微量神经组织的获取、消化和机械解离无菌条件下获取新生SD大鼠眶内段视神经及海马等微量神经组织，于消化酶Accusase内消化60～90分钟后，经机械吹打解离成细胞悬液，过滤后种植在多聚赖氨酸涂布的培养板内，用含有2％B27添加剂、1％N2添加剂和血小板源生长因子的无血清培养基进行培养；(2)原代细胞培养与少突胶质前体细胞克隆形成细胞贴壁培养4天后，出现少突胶质前体细胞增殖克隆；与此同时，贴壁的其它非少突胶质前体细胞如星形胶质细胞等，增殖速度相对缓慢，培养细胞中少突胶质前体细胞的总体比例明显提高；(3)利用特定成分短暂撤除方法降低少突胶质前体细胞粘附性原代细胞培养10天后，更换为不含B27添加剂的培养基；培养2～3天后，少突胶质前体细胞出现明显突起回缩，胞体发亮变圆，与培养底面的接触面积明显变少，易于脱壁；与此同时，其它非少突胶质前体细胞如星形胶质细胞形态无明显改变；(4)利用机械分离方法纯化少突胶质前体细胞将上述培养细胞在无菌操作台内轻轻震荡或吹打，使大部分少突胶质前体细胞脱壁，而绝大部分非少突胶质前体细胞仍牢固贴壁；收集脱壁少突胶质前体细胞进行培养，重新加入2％B27添加剂，并添加碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)；(5)少突胶质前体细胞的传代培养以及诱导分化机械分离纯化的少突胶质前体细胞在加入2％B27添加剂以及bFGF后，快速贴壁并增殖，细胞呈典型的双极或三极形态，纯度达98％以上；细胞传代：Accusase消化2～3分钟后用D‑PBS清洗，加入完全培养基(含bFGF)吹打使细胞脱壁，收集细胞按1:2或1:3比例传代；细胞分化：将细胞培养基中的PDGF及bFGF撤除，添加15nm的三碘甲状腺原氨酸(T3)，继续培养5‑10天，每3天更换培养基一次。