[发明专利]高通量筛选ALKBH5小分子抑制剂的方法在审
| 申请号： | 201710985600.1 | 申请日： | 2017-10-20 |
| 公开（公告）号： | CN107557430A | 公开（公告）日： | 2018-01-09 |
| 发明（设计）人： | 刘宏民;申丹丹;郑一超 | 申请（专利权）人： | 郑州大学 |
| 主分类号： | C12Q1/32 | 分类号： | C12Q1/32;C12Q1/26;G01N21/64 |
| 代理公司： | 郑州联科专利事务所(普通合伙)41104 | 代理人： | 时立新 |
| 地址： | 450001 河南*** | 国省代码： | 河南;41 |
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| 摘要： | 本发明涉及药物化学领域，具体公开了利用FDH酶联荧光原理和AlphaScreen技术分别筛选ALKBH5小分子抑制剂的方法。该方法先成功构建并原核表达纯化得到纯度较高的ALKBH5重组蛋白，合成m6A修饰的ssRNA作为底物。用FDH酶联荧光原理和AlphaScreen技术检测ALKBH5的活性并建立其小分子抑制剂筛选平台。FDH酶联荧光反应体系稳定，所用试剂便宜，易得，背景低；AlphaScreen反应体系稳定，受到样品的干扰非常少，假阳性假阴性均低，可去除天然产物自发荧光的干扰，灵敏度高；这两种方法均易于实现微型化，通量高且相互补充，可实现ALKBH5小分子抑制剂的筛选。 | ||
| 搜索关键词： | 通量 筛选 alkbh5 分子 抑制剂 方法 | ||
【主权项】：
一种筛选ALKBH5小分子抑制剂方法，其特征在于，利用酶联荧光原理筛选ALKBH5小分子抑制剂，具体方法如下：（1）以pET‑28b为表达载体，FDH全长基因序列为活性片段，将其克隆到表达载体上，构建并原核表达纯化FDH重组蛋白；（2）以pMCSG19为表达载体，ALKBH5全长基因序列为活性片段，将其克隆到表达载体上，构建并原核表达纯化ALKBH5重组蛋白；（3）以不同浓度的甲醛作为底物检测FDH的活性，作标准曲线，确定底物浓度；然后以ssRNA作为ALKBH5的底物，检测ALKBH5的活性；（4）缓冲溶液中，加入FDH和ALKBH5重组蛋白，NAD作为FDH的辅酶，α‑酮戊二酸，Fe2+作为ALKBH5的辅酶，根据NADH在360nm，460nm的荧光强度筛选ALKBH5抑制剂；底物ssRNA浓度选10µM‑40µM。
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