[发明专利]一种构建小鼠TCRalphaCDR3区文库的方法

摘要

本发明涉及一种构建小鼠TCR alpha CDR3区测序文库的方法，主要步骤包括(1)提取鼠组织或全血总RNA。(2)逆转录RNA为cDNA，将接头序列连接到长链cDNA末端，通过通用C端引物和接头序列引物扩增包含CDR3区的TCR alpha。(3)通过Tn5转座酶打断TCR alpha并富集CDR3区序列。(4)通过illumina高通量测序平台进行测序。本方法适用于含有各类T细胞的组织，体液等样本的建库；采用5’RACE技术，可高效的无偏差的对小鼠TCR alpha进行扩增，克服了多重PCR扩增所引起的模板拷贝数和扩增效率难以控制，产物发生偏移等问题；利用Tn5酶能将DNA打断和接头连接同步完成的功能和使用特异性的引物可对TCR alpha的高度可变区(CDR3区)进行快速准确的富集建库，使测序更有针对性，方便数据分析，节约测序成本。

主权项

一种构建小鼠TCR alpha CDR3区文库的方法，其特征在于：(1)提取小鼠组织或全血总RNA；(2)以RNA为模板，SEQ ID NO.1为引物逆转录合成cDNA，在逆转录酶作用下将SEQ ID NO.4连接至cDNA的3’端；(3)采用半巢式PCR特异性扩增TCR alpha片段：使用SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5进行第一轮PCR；使用SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.5进行第二轮PCR；其中SEQ ID NO.5作为通用引物，SEQ ID NO.3为在TCR alpha的C端序列，并带有测序接头；(4)使用磁珠纯化第二轮PCR产物；使用Tn5建库试剂盒进行DNA打断，使用SEQ ID NO.6与SEQ ID NO.7进行测序接头连接，建库；(5)文库用于illumina高通量测序平台测序。