[发明专利]自然杀伤细胞培养基质及自然杀伤细胞的扩增培养方法

摘要

本发明提供了一种自然杀伤细胞培养基质及自然杀伤细胞的扩增培养方法，涉及细胞培养技术领域。本发明自然杀伤细胞培养基质主要由无血清培养基、自体血浆和细胞因子组成，应用该细胞培养基质的自然杀伤细胞的扩增培养方法，通过Lymactin‑NK抗体联合细胞培养基质中的细胞因子诱导人源外周血单个核细胞释放危险信号，间接通过抗体激活自然杀伤细胞并增强细胞杀伤活性。该方法可以在短周期内大量高效的扩增得到高质量的自然杀伤细胞，同时，该方法得到自然杀伤细胞具有纯度高以及细胞毒性强等优点。有效缓解了现有自然杀伤细胞培养方法中存在的生产工艺繁琐、生产成本较高以及自然杀伤细胞扩增倍数低，纯度不高难以大规模生产的问题。

主权项

一种自然杀伤细胞的扩增培养方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：步骤1：使用X‑VIVO 15:AlyS505NK‑AC＝1:1的无血清培养基重悬人源外周血单个核细胞，并将培养基中的细胞浓度调整至1.5×10⁶/mL，随后接种至包被有Lymactin‑NK抗体的细胞培养瓶中；步骤2：将自体血浆加入步骤1细胞培养瓶中，自体血浆在自然杀伤细胞培养基质中的浓度为5％，并添加细胞因子：IL‑2 1000IU/mL，IL‑7 20ng/mL，IL‑12 5ng/mL，IL‑15 20ng/mL，IL‑21 10ng/mL，随后进行诱导培养14天；步骤3：在诱导培养过程中前7天，每3天进行一次补液，使用补液培养基调整细胞密度为1.5×10⁶/mL，并补加自体血浆和IL‑2、IL‑7、IL‑12、IL‑15、IL‑21细胞因子；在诱导培养过程中后7天，每3天进行一次补液，使用补液培养基调整细胞密度为1.5×10⁶/mL，并补加IL‑2和IL‑15细胞因子；步骤4：在诱导培养14天时收集自然杀伤细胞，将收集到的自然杀伤细胞用PBS缓冲液清洗3次，得到自然杀伤细胞；所述步骤1包被有Lymactin‑NK抗体的细胞培养瓶的制备方法为：将浓度为0.6mg/mL的Lymactin‑NK抗体包被在细胞培养瓶中，包被条件为37℃，孵育时间为2h，得到包被后的细胞培养瓶；所述步骤2自体血浆的制备方法为：采集外周血，将采集的外周血转移至50mL离心管中，在2000rmp，20℃的离心条件下离心10分钟得到步骤2自体血浆；所述步骤1人源外周血单个核细胞的制备方法为：采集外周血，将采集的外周血转移至50mL离心管中，在2000rmp，20℃的离心条件下离心10分钟得到自体血浆，随后使用淋巴细胞分离液分离并收集人源外周血单个核细胞，然后将收集到的人源外周血单个核细胞用PBS缓冲液清洗三次，得到步骤1人源外周血单个核细胞；其中，使用淋巴细胞分离液分离并收集人源外周血单个核细胞的步骤具体包括：1、将吸取自体血浆后的血液样本按照1：1的比例加入PBS，混匀；2、将稀释后的血液样本缓慢加在淋巴细胞分离液面上，稀释后的血液样本与淋巴细胞分离液的比例为1：1；3、离心，转速2000rpm，时间15min，慢升慢降，离心温度为20℃；4、离心后吸取单个核细胞层细胞。