[发明专利]检测电子烟气溶胶水提物对细胞炎症因子分泌量影响的方法

摘要

本发明公开了一种检测电子烟气溶胶水提物细胞炎症因子分泌量影响的方法。包括样品前处理、单细胞悬浮液制备、细胞浓度计算、细胞接种、受试物暴露、受试物孵育品收集、标准溶液配制、加样、加抗、加酶、显色、吸光值测量和细胞炎症因子分泌量测定等步骤。本发明综合考察了电子烟制品的使用特点和作用方式，建立了全新的样品前处理方法，选取人肺成纤维细胞HPF作为试验检测用细胞，并确定了样品检测剂量。样品的有效处理、检测剂量的优化设定以及靶细胞的正确选择，使得本发明方法能够准确有效地检测电子烟气溶胶水提物对受试细胞炎症效应的影响。

主权项

一种检测电子烟气溶胶水提物细胞炎症因子分泌量影响的方法，具体为以下步骤：(1)样品前处理：采用直线型吸烟机，在抽吸容量为55.0ml，持续时间3s，抽吸频率30s的条件下，连续抽吸100口电子烟，用装有FM细胞培养基的捕集瓶捕集电子烟烟雾，捕集浓度为20口/mL，捕集液用0.22μm无菌过滤器过滤除菌，得到电子烟烟雾的气溶胶水提物作为待测液，‑80℃保存待用；(2)单细胞悬浮液的制备：人肺成纤维细胞HPF复苏后，接种到25cm2细胞培养瓶中，加入10mL FM细胞培养基，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，倒置显微镜观察培养细胞的汇合和形态情况，待细胞长至70％～90％的汇合率时，移除培养瓶中的FM细胞培养基，用磷酸缓冲液洗两次，弃洗液；加入1mL 0.25％(w/v)的胰蛋白酶溶液单层孵育1～2min，用FM细胞培养基悬起，形成单细胞悬浮液；(3)单细胞悬浮液的细胞浓度计算：用血球计数板计数法对所得单细胞悬浮液的细胞浓度进行计算，得到每毫升单细胞悬浮液的活细胞数；(4)细胞接种：将计数后的单细胞悬浮液用FM细胞培养基稀释至2.0×105个/mL，再按接种量为1mL/孔接种到12孔细胞培养板中，然后将12孔细胞培养板置于37℃、5％CO2培养箱内培养24h；(5)受试物暴露：取出12孔细胞培养板，去除细胞培养液，按照表1将不同剂量的待测液加入细胞培养板中，每个剂量设3个复孔，置于37℃，5％CO2培养箱中培养24h；表1 电子烟气溶胶水提物对细胞炎症效应因子分泌量影响的检测加样表(6)受试物孵育品的收集：培养完成后，分别收集12孔细胞培养板每孔中的上清液，1000rpm离心20min，然后用不同的1.5ml离心管分别收集各孔的离心后上清液备用；(7)标准溶液配制：梯度稀释法配制炎症效应因子的标准曲线溶液；(8)加样：取96孔酶标板，在空白对照孔中加PBS磷酸盐缓冲液100ul，其余孔分别加标准曲线溶液和备用的离心后上清液各100ul，酶标板覆膜，37℃，孵育90分钟；(9)加入抗体：加样孵育完成后，取出96孔酶标板，弃液，甩干，每孔加入抗体工作液100ul，盖酶标板覆膜，37℃，孵育60分钟；(10)洗板、加酶：加抗孵育完成后，取出96孔酶标板，弃液，甩干，加入清洗液350ul/每孔，浸泡2分钟，弃液，甩干，并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干；重复洗板3次；然后在每孔中加酶结合工作液100ul，盖酶标板覆膜，37℃孵育30分钟；(11)洗板、显色：加酶孵育完成后，取出96孔酶标板，弃液，甩干，加入清洗液350ul/每孔，浸泡2分钟，弃液，甩干，并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干；重复洗板5次；然后在每孔中加底物工作液90ul，盖酶标板覆膜，37℃孵育，30min后加入终止液50ul/孔；(12)测量吸光值：在酶标仪450nm下检测吸光度；(13)细胞炎症因子分泌量测定：根据标准溶液吸光度值绘制标准曲线，计算样品的细胞炎症因子分泌量。