[发明专利]用于表达限制性内切酶FspI的甲基化保护菌株的筛选方法

摘要

一种用于表达限制性内切酶FspI的甲基化保护菌株的筛选方法，通过甲基转移酶M.HhaI基因的获取，构建甲基转移酶M.HhaI的重组表达菌株，甲基化保护菌株的筛选，限制性内切酶FspI基因的获取，构建限制性内切酶FspI的重组表达菌株；再限制酶FspI的重组表达，获得限制酶FspI的重组表达菌株。本发明方法实现了限制酶FspI的高效重组表达；利用乳糖操纵子表达系统进行限制酶FspI的重组表达；抵抗限制酶FspI对宿主基因组DNA的酶切，相对无甲基化保护的表达系统，可稳定且高效进行限制酶FspI的重组表达；筛选出的M.HhaI甲基化保护菌株同样可应用于其他具有类似识别位点的限制酶的重组表达。

主权项

一种用于表达限制性内切酶FspI的甲基化保护菌株的筛选方法，其特征在于，（1）甲基转移酶M.HhaI的重组表达菌株的建立a、甲基转移酶M.HhaI基因的获取甲基转移酶M.HhaI基因的获得采用PCR扩增、基因合成或者提取染色体DNA并建立文库方法，从菌株Haemophilus haemolyticus的基因组中使用甲基转移酶M.HhaI基因的特异性引物获得了甲基转移酶M.HhaI的基因；b、构建甲基转移酶M.HhaI的重组表达菌株将M.HhaI基因序列以酶切‑连接的方式插入低拷贝表达载体pACYC184质粒中，连接产物转化进入克隆菌株DH5α并涂布于氯霉素抗性平板进行培养；c、甲基化保护菌株的筛选对转化后菌株进行甲基化保护程度的筛选；d、限制性内切酶FspI基因的获取限制酶FspI基因的获得采用PCR扩增、基因合成或者提取染色体DNA并建立文库的方法，从菌株Fischerella muscicola SAG 1427‑1的基因组中使用限制酶FspI基因的特异性引物获得限制酶FspI的基因；e、构建限制性内切酶FspI的重组表达菌株使用乳糖操纵子表达系统，将FspI基因序列以酶切‑连接的方式插入PET28b表达质粒中，连接产物转化进入DH5α表达菌株并涂布于卡纳霉素抗性平板进行培养；通过测序，确认重组质粒的构建成功后转化进入R.FspI特异性保护菌株[pACYC184‑M.HhaI，ER2566]，构建限制酶FspI的重组表达菌株；（2）限制酶FspI的重组表达将测序正确的重组表达质粒pET28b‑R.FspI转化感受态细胞[pACYC184‑M.HhaI，ER2566]，涂布于含卡那霉素和氯霉素抗生素的平板上筛选培养，获得限制酶FspI的重组表达菌株；该菌株经扩大培养后，以IPTG诱导，获得限制酶FspI的重组蛋白，并确认细菌蛋白粗提液具有限制酶FspI的活性。