[发明专利]一种农杆菌介导的麻竹转化方法

摘要

本发明公开了一种农杆菌介导的麻竹转化方法，包括外植体的准备、农杆菌侵染菌液的制备、侵染、筛选、不定芽的诱导和诱导生根步骤。利用农杆菌去侵染麻竹茎端外植体，在含有2 mg/L 2,4‑D和200μM乙酰丁香酮的NB培养基中共培养，经过有道筛选等步骤最终获得转基因麻竹。本发明使用农杆菌介导的高效转化体系，首次建立了以麻竹营养器官为起始的麻竹的转基因体系，该体系能够突破克服传统的育种方法在竹类中无法应用的障碍，为将来通过转基因技术进行麻竹的分子育种提供前提；通过该方法，在基础研究领域为研究竹类基因功能提供了技术支撑。

主权项

1.一种农杆菌介导的麻竹转化方法，其特征在于：具体包括以下步骤：（1）外植体的准备：取生长于温室中的麻竹幼嫩茎端，洗涤、灭菌后，切成0.5‑1cm的小段，其中结节的部位位于末端伤口处；将切断后的茎端放置于愈伤诱导培养基上，进行暗培养，培养温度为26℃；1.5个月后，待诱导出愈伤组织后，移入到愈伤增殖培养基中，并在该培养基中培养7‑8个月，产生淡黄色的胚性愈伤组织，并将其作为农杆菌侵染对象；（2）农杆菌侵染菌液的制备：将含有目的基因的农杆菌划线培养，随后转移至含有50 mg/L卡那霉素的YEB培养基中，并于28℃振荡培养过夜，然后按照1:100的体积比例将培养基稀释，并将其添加到含有50 mg/L的卡那霉素和200 μM的乙酰丁香酮的YEB培养基中，继续培养至OD为0.6‑0.8；离心后去除上清液，将所得菌液悬浮于含有200 μM的乙酰丁香酮的AMM液体培养基中，稀释至OD为0.8，得到农杆菌侵染菌液；（3）侵染：将步骤（1）中增殖出胚性愈伤组织的外植体浸入步骤（2）得到的农杆菌侵染菌液中，真空处理15分钟后室温放置15分钟；取出侵染过的外植体，置于无菌台中，用灭菌的滤纸吸干表面菌液，后转入含有2 mg/L 2,4‑D和200 μM乙酰丁香酮的NB培养基中，在25℃、黑暗条件下共培养4天；（4）筛选：将步骤（3）共培养完毕的愈伤组织在400 mg/L的羧苄青霉素中清洗3‑5遍，后在抗性愈伤扩增培养基中进行筛选培养，逐渐形成胚性愈伤组织，用于不定芽的诱导；所述筛选培养的条件为：26℃的黑暗条件下培养4个月；（5）不定芽的诱导：将步骤（4）筛选培养得到的愈伤组织放置到抗性芽诱导培养基中进行不定芽诱导培养，培养条件为：培养温度为26℃，70 μmol m^‑2 s^‑1，光照条件下培养16h，黑暗下培养8小时；不定芽诱导培养后，在芽增殖培养基中进行不定芽伸长培养，培养条件为：光照条件下培养16 h，光照强度70 μmol m^‑2 s^‑1；所述芽增殖培养基的配方与芽诱导培养基的培养相同；（6）诱导生根：当再生的芽生长到3‑4厘米长时，转入到不含有抗生素的诱导生根培养基中进行培养，培养条件为：培养温度为26℃，70 μmol m^‑2 s^‑1，光照条件下培养16h，黑暗下培养8小时；诱导生根后即成为完整的麻竹转基因植株，后移栽入土；步骤（1）中所述的愈伤诱导培养基的配方为：MS+2,4‑D 8 mg/L + IBA 0.5 mg/L+250 mg/L PVP+3g/L 山梨醇+ 30 g/L 蔗糖；步骤（1）中所述愈伤增殖培养基的配方为：3/4MS+3g/L 山梨醇+30 g/L 蔗糖+250 mg/L PVP+2mg/L 2,4‑D；步骤（4）中所述的抗性愈伤扩增培养基的配方为：3/4MS+3g/L 山梨醇+30 g/L 蔗糖+250 mg/L PVP+2mg/L 2,4‑D+35 mg/L潮霉素+400 mg/L羧苄青霉素；步骤（5）中所述的抗性芽诱导培养基的配方为：35 mg/L潮霉素+200 mg/L羧苄青霉素+MS培养基+蔗糖 30 g/L+ TDZ 0.1mg/L+ NAA 0.5 mg/L＋250 mg/L PVP+琼脂粉8 g/L；步骤（6）中所述的诱导生根培养基的配方为：MS+IAA 1 mg/L+30 g/L 蔗糖+35 mg/L潮霉素。