[发明专利]一种细胞周期阻滞剂KR在人肺癌细胞中的应用

摘要

本发明提供了一种细胞周期阻滞剂KR在人肺癌细胞中的应用，属于生物化学与分子生物学技术领域。一种细胞周期阻滞剂KR在人肺癌细胞中的应用，步骤如下细胞复苏；(2)细胞培养；(3)药物配制；(4)处理细胞；(5)检测细胞增殖抑制率；(6)检测细胞周期。本发明的数据建立在KR可以上调CDKN1A引起ATP耗竭，导致细胞周期阻滞在G0/G1期，有非常显著的体外增殖抑制活性的基础之上。

主权项

一种细胞周期阻滞剂KR在人肺癌细胞中的应用，其特征在于，步骤如下：(1)细胞复苏：将装有冻存人肺癌细胞株A549的冻存管从‑80℃冰箱中取出，迅速放入37℃水浴锅中，轻微摇动，待液体融化；将冻存管中的人肺癌细胞株A549悬浮于含有10％灭活胎牛血清的无菌RPMI 1640培养液的离心管中，1000rpm，5min离心，离心结束后，弃上清，轻轻弹起细胞，再次入无菌RPMI 1640培养液与离心管中，把细胞悬浮起来，转移到培养瓶中左右轻轻摇动，使培养瓶中的细胞均匀分布，得到复苏的人肺癌细胞株A549；(2)细胞培养：将复苏的人肺癌细胞株A549置于浓度为5％CO2、相对湿度为90％、温度为37℃的培养箱中培养，10h后观察细胞，若已贴壁，将培养液全部吸出，再次加入等量的RPMI 1640培养液；待细胞长至培养瓶底面积的70％～80％传代1次；(3)药物配制：用无菌的不含血清的RPMI 1640培养基溶解KR粉末，使KR溶液的母液浓度达到1.2mM，继续用无菌RPMI 1640培养基将溶解好的KR溶液的母液稀释至浓度为2μM‑200μM，过滤除菌，室温保存；(4)处理细胞：将处于对数生长期的细胞用胰酶消化，细胞计数后，稀释，稀释细胞密度为3×104～5×104个/ml，吹打混匀，将细胞接种于96孔板中，每孔取100μl人肺癌细胞株A549，12h后，待细胞贴壁后，设置7组实验，每组4个复孔，第1组：空白对照组；第2组：120μΜKR组；第3组：20μΜKR组；第4组：10μΜKR组；第5组：2μΜKR组；第6组：1μΜKR组；第7组：0.2μΜKR组；分别向各组中加入10μl对应的药物，轻轻混匀后，置于浓度为5％CO2、相对湿度为90％、温度为37℃的培养箱中孵育2天，检测细胞增殖抑制活性；(5)检测细胞增殖抑制率：将步骤(4)处理后的细胞，置于浓度为5％CO2、相对湿度为90％、温度为37℃的培养箱中孵育48h，各4个复孔；采用MTT试剂盒进行检测，每孔细胞悬液中加20μl MTT溶液，置于37℃，CO2培养箱中孵育3h，测定490nm处各组细胞的吸光度，记录数据；(6)检测细胞周期：将处于对数生长期的细胞用胰酶消化，细胞计数后，取适量细胞进行稀释，稀释细胞密度为1×105～1.5×105个/ml，吹打混匀，将细胞接种于6孔板中，每孔加入2ml人肺癌细胞株A549，12h后，待细胞贴壁后，设置空白对照组和10μΜ KR组，向10μΜ KR组中加入KR，使KR的浓度为10μΜ KR，轻轻混匀后，置于浓度为5％CO2、相对湿度为90％、温度为37℃的培养箱中孵育36h，用15ml离心管分装成两个样品，按照细胞周期与凋亡检测试剂盒说明书固定细胞并配制碘化丙染色缓冲液，12h后，每个样品中加入PBS洗多次次，重悬细胞，每个样品加入所需碘化丙染色缓冲液37℃避光孵育30min，最后用PBS洗两次；300目筛网过滤后用BD FACSCalibur流式细胞仪上机检测。