[发明专利]一种水体微生物污染来源定量解析方法

摘要

本发明公开了一种水体微生物污染来源定量解析方法，选取针对目标区域具有特异性强、灵敏度高且可定量分析的特异性生物标记引物，通过qPCR扩增技术构建标准曲线方程。再采集实际水域样品，提取水样品中的基因组DNA；采用区域特异性引物进行qPCR扩增，结果代入标准曲线方程进行计算，得出目标水域中各微生物的浓度值，根据各微生物的浓度值来解析区域目标水域的污染源。通过本发明的方法可识别低浓度的目标微生物，适用于不同水质的环境水体，为环境水体的监测、溯源和治理提供了可靠的依据。

主权项

1.一种适用于中国珠三角地区水体微生物污染来源定量解析方法，包括以下步骤：(1)引物区域性验证：在区域目标水域周边采集不同生物的粪便样品，样品采集后保存于冰盒中，送回实验室进行后续处理；采用粪便基因组DNA提取试剂盒通过悬浮、破碎、吸附柱纯化步骤从粪便样品中提取基因组DNA，置于冰箱低温储存；以各生物粪便中提取的基因组DNA为模板，选取已有的各生物拟杆菌特异性引物分别进行qPCR扩增，分析引物的灵敏度与特异性；选取灵敏度和特异性较高的引物作为区域特异性引物；引物的灵敏度与特异性判定依据为：将Cq＝32.0所对应的拷贝数作为最低定量限来验证引物的特性，当引物扩增的Cq<32.0且熔解曲线呈现单一的熔解峰时判定为阳性结果，而Cq≥32.0时判定为阴性结果；选取灵敏度和特异性都在85％以上的引物作为区域特异性引物；筛选出的区域特异性引物为：人源特异性引物qHS601F/qBac725R、反刍动物特异性引物BacB2‑590F/Bac708Rm、猪源特异性引物Bac41F/Bac163R及鸡源特异性引物qC160F‑HU/qBac265R‑HU；其中，引物qHS601F/qBac725R的序列为：GTTGTGAAAGTTTGCGGCTCA/CAATCGGAGTTCTTCGTGATATCTA，引物BacB2‑590F/Bac708Rm的序列为：ACAGCCCGCGATTGATACTGGTAA/CAATCGGAGTTCTTCGTGAT,引物Bac41F/Bac163R的序列为：GCATGAATTTAGCTTGCTAAATTTGAT/ACCTCATACGGTATTAATCCGC,引物qC160F‑HU/qBac265R‑HU的序列为：AAGGGAGATTAATACCCGATGATG/CCGTTACCCCGCCTACTAC；(2)标准曲线制作：以区域特异性引物对提取的基因组DNA进行PCR扩增，对扩增后的目标产物进行纯化回收，连接到pMD 19‑T Vector载体上，转化DH5α感受态细胞，采用含有氨苄抗生素的平板培养基挑取阳性克隆，提取质粒DNA，测定其浓度；将质粒梯度稀释，并以此为模板，进行qPCR扩增；反应结束之后，进行标准曲线的制作；标准曲线的判定依据为：标准曲线的相关系数(R²)大于0.99，结果可信；扩增效率(E)是通过标准曲线斜率来确定的，两者符合公式E＝10^(‑1/Slope)‑1；如果一个反应的标准曲线斜率为‑3.32，则该反应的扩增效率E＝100％，扩增效率(E)在90％～110％之间是可接受的；(3)污染源解析：从区域目标水域进行水样品采集，所有样品采集后进行编号并保存于冰盒中，在实验室中提取水样品中的基因组DNA；采用区域特异性引物进行qPCR扩增，结果经标准曲线公式进行计算，得出目标水域中各微生物的浓度值，根据各微生物的浓度值来解析区域目标水域的污染源；其中所述qPCR扩增条件：扩增体系为20μL：Premix Ex TaqTM II(2×)10μL；ddH₂O，6.4μL；上下游引物各0.8μL；DNA模板2μL；扩增程序：①预变性，95℃，30s；②变性，95℃，5s；③退火延伸，60℃，1min；40个循环。