[发明专利]用转基因斑马鱼检测具乙酰胆碱酯酶抑制活性物质的方法

摘要

本发明公开了一种利用转基因斑马鱼检测具乙酰胆碱酯酶抑制活性物质的方法。本发明构建了tg(‑6kb hspb11egfp)和tg(hspb11egfp)转基因斑马鱼，可利用其检测待测物质是否为具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的物质，检测待测水体是否被具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的物质污染。实验证明其能够用于评价乙酰胆碱酯酶抑制剂导致斑马鱼体内所产生的生物效应，由于其是一种基于斑马鱼hspb11基因的上游调控序列调控报告基因即荧光蛋白编码基因表达的检测方法，因而具有简单、快速和廉价的特点；另外，对具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的化学物质具有特异性和敏感性；且适用于对含有乙酰胆碱酯酶抑制剂的水溶液进行检测。

主权项

一种利用转基因斑马鱼检测待测物质是否为具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的物质的方法，包括如下步骤：(A1)向转基因斑马鱼的培养体系中加入不同浓度的待测物质，使培养体系中所述待测物质的浓度呈现一定的浓度梯度，经过24‑72小时暴露，检测所述转基因斑马鱼的肌肉和/或脊索细胞的荧光强度值，记录经不同浓度的所述待测物质暴露诱导的所述转基因斑马鱼的肌肉和/或脊索细胞的荧光强度值；所述转基因斑马鱼为转基因斑马鱼A或转基因斑马鱼B；所述转基因斑马鱼A为向受体斑马鱼中转入修饰后的BAC DNA，经过同源重组后得到的；所述修饰后的BAC DNA是将斑马鱼BAC DNA中的hspb11基因的外显子部分替换为含有荧光蛋白编码基因的片段后得到的；所述转基因斑马鱼B为向受体斑马鱼中转入含有目的DNA片段的重组质粒后得到的，所述目的DNA片段自上游到下游依次含有hspb11基因6kb上游调控序列、荧光蛋白编码基因及抗性筛选标记基因；(A2)如果经过不同浓度的所述待测物质暴露后，存在至少一个浓度使得所述转基因斑马鱼的肌肉和/或脊索细胞的荧光强度值显著高于本底值，则所述待测物质为或候选为具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的物质；反之，则所述待测物质不为或候选不为具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的物质；所述本底值为没有加入所述待测物质的所述转基因斑马鱼培养体系中培养的所述转基因斑马鱼的肌肉和/或脊索细胞的荧光强度值。