[发明专利]一种米兰花组培繁殖的种质保存方法

摘要

本发明公开了一种米兰花组培繁殖的种质保存方法，包括以下技术环节：1）米兰花预处理；2）外植体取材、消毒与接种；3）不定芽诱导；4）慢生长增殖保存种质；5）活化；6）不定芽壮根后移栽。本发明提供的米兰花组培繁殖的种质保存方法可显著延长米兰花种质的保存时间，同时大大节省保存所需的劳力、物力和空间，而且操作简便，米兰花性状保存稳定可靠，移栽成活率高，移栽后米兰花植株生长健壮，有效保持了米兰花种质的优良性状，具有重要的产业推广价值。

主权项

1.一种米兰花组培繁殖的种质保存方法，其特征在于，该种质保存方法包括以下技术步骤：1）米兰花预处理：将生长健壮、无病虫害的米兰花植株取材后进行根部清洗，然后将根部浸入装有0.01g/L的多氯苯甲酸溶液中，7‑8℃低温黑暗预处理3‑5天；2）外植体取材、消毒与接种将米兰花植株超纯水洗净后转入超净工作台进行无菌操作，剥去叶片，露出米兰花嫩茎，将嫩茎先用浓度为75%酒精浸泡30s，然后投入加入了数滴吐温80的0.1%升汞溶液中，表面消毒12‑15m后用灭菌水冲洗3‑5次，滤纸吸干，将嫩茎用灭菌解剖刀分割成0.6‑0.9cm的小茎段，然后将小茎段正向接种于装有诱导培养基的三角瓶中；3）不定芽诱导培养室温度控制为27±1℃，光照强度控制为1500‑2000Lx，光周期控制为光12h/暗12h，25‑35天诱导出不定芽；4）慢生长增殖保存种质：将不定芽接种至慢生长增殖培养基A或慢生长增殖培养基B中，然后将三角瓶转移到低温、弱光条件下缓慢生长，12个月继代接种一次，慢生长增殖培养基A和慢生长增殖培养基B继代接种交替使用，然后继续进行慢生长增殖步骤；5）活化当米兰花种质保存期结束，需要将米兰花不定芽恢复活性，将慢生长增殖的不定芽转接入活化培养基，然后转移到温度控制27±1℃，光照强度控制为1500‑2000Lx，光周期控制为光12h/暗12h，获得健壮的米兰花不定芽；6）不定芽壮根后移栽：将米兰花不定芽转接到壮根培养基中，控制温度为26‑28℃、光照强度为2200‑2600 Lx培养条件下生长20‑25天诱导生根，然后打开培养瓶炼苗7‑9天后移栽入大田；所述步骤2）中诱导培养基配方为：MS＋2，4‑D 2mg/L+NAA 0.25mg/L+复酞核酸0.6mg/L+蔗糖40g/L+氯化2‑羟乙基三甲铵 0.25g/L+植物硫化激动素PSK‑α 55pmol/L+甲基亚硝基脲 1.5g/L+水解蛋白0.3g/L+活性炭1.5g/L+琼脂6.5g/L，pH 5.8‑6.0；所述步骤4）中的慢生长增殖培养基A的配方为：KNO3 2200～2600mg/L，NH4NO3 1600～1800mg/L，KH2PO4 160～180mg/L，CaCl2∙2H2O 430～450mg/L，MgSO4∙7H2O 360～380mg/L，Na2‑EDTA 30～35mg/L，FeSO4∙7H2O 22～26mg/L，MnSO4∙4H2O 21～24mg/L，ZnSO4∙7H2O 8～9mg/L，H3BO3 0.1～0.2mg/L，KI 0.6～0.8mg/L，肌醇 90～110mg/L，甘氨酸 1.8～2.2mg/L，白喉霉素 0.6～0.8mg/L，维生素B1 0.35～0.45mg/L，维生素B6 0.45～0.55mg/L，蔗糖 23～27g/L，甘露醇27～33g/L，植物凝胶 5.2～5.8g/L，NAA 0.15～0.25mg/L，2，4‑D 0.8～1.2mg/L，调环酸钙0.9～1.1mg/L，生物素 0.15～0.17mg/L，植物硫化激动素PSK‑α 15‑25pmol/L，山梨醇 23～27g/L，水解蛋白 0.9～1.1g/L，pH 5.8‑6.0；所述的慢生长增殖培养基B的配方为：KNO3 2200～2600mg/L，NH4NO3 1600～1800mg/L，KH2PO4 160～180mg/L，CaCl2∙2H2O 20～30mg/L，MgSO4∙7H2O 360～380mg/L，Na2‑EDTA 30～35mg/L，FeSO4∙7H2O 22～26mg/L，MnSO4∙4H2O 21～24mg/L，ZnSO4∙7H2O 0.1～0.2mg/L，H3BO3 5～6mg/L，KI 0.6～0.8mg/L，CuSO4·5H2O 0.04～0.06mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.15～0.2mg/L，CoCl2·6H2O 0.15～0.2mg/L，肌醇 90～110mg/L，甘氨酸 1.8～2.2mg/L，白喉霉素 0.6～0.8mg/L，维生素B1 0.35～0.45mg/L，维生素B6 0.45～0.55mg/L，蔗糖 23～27g/L，甘露醇27～33g/L，植物凝胶 5.2～5.8g/L，NAA 0.15～0.25mg/L，2，4‑D 0.8～1.2mg/L，调环酸钙0.9～1.1mg/L，生物素 0.15～0.17mg/L，植物硫化激动素PSK‑α 15‑25pmol/L，山梨醇 23～27g/L，水解蛋白 0.9～1.1g/L，pH 5.8‑6.0；所述步骤4）中的低温、弱光条件为：培养温度控制为5‑7℃，光照强度控制为400‑500lx，光周期控制为光12h/暗12h；所述步骤5）中的活化培养基的配方为：MS+2.5mg/L2，4‑D+0.2mg/LNAA+植物硫化激动素PSK‑α 30pmol/L+35g/L蔗糖+25g/L聚乙二醇+1g/L水解蛋白+5.5g/L植物凝胶，pH 5.8‑6.0；所述步骤6）中的壮根培养基的配方为：1/2MS+多效唑0.08mg/L+蔗糖15g/L，pH为5.8‑6.0。