[发明专利]一种大鼠纤维化肺细胞的培养方法及其检测方法

摘要

本发明公开了一种大鼠纤维化肺细胞的培养方法及其检测方法，先配制培养液、灌注液和清洗液，然后对大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞进行取材和原代培养，然后用胺碘酮刺激Ⅱ型肺泡上皮细胞得到纤维化肺细胞，并对纤维化肺细胞进行了检测，本发明培养方法能在短时间内获取大量细胞，能够准确反映体内胺碘酮诱导肺纤维化情况，深入研究Ⅱ型肺泡上皮细胞表型转化调控及机制对延缓乃至逆转胺碘酮诱导的肺纤维化来说意义重大，为从细胞和分子水平进一步探索胺碘酮诱导肺纤维化机制的发病机制提供研究客体。

主权项

1.一种大鼠纤维化肺细胞的培养方法及其检测方法，其特征在于：包括以下步骤：/n步骤一、培养基、灌注液和清洗液的配制：配制DMEM培养基，再加入终浓度100ml/L胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素；配制灌注液，用PBS配制成质量分数0.1％的胰蛋白酶，再加入终浓度100U/ml青霉素、100U/ml链霉素和质量分数0.02％的EDTA，然后过滤除菌得到灌注液；配制PBS清洗液，再加入终浓度100U/ml青霉素和100U/ml链霉素；/n步骤二、取材：大鼠腹腔内注射麻醉药进行麻醉，腹腔注射肝素钠2800-3000U，将大鼠处死后打开胸腔，用清洗液经右心室肺动脉洗去血液，然后取出肺，用灌注液灌注肺泡腔，放在37℃振动水浴中孵育10-30min，去除气管、大气道和心脏，在含有DNA酶Ⅰ的培养皿中将肺切成1-3mm3的碎块，往培养皿中加入3-6ml小牛血清灭活酶，将样品离心5-10min，弃上清液，将沉淀物用清洗液重悬，加入37℃预温的红细胞裂解液，反复吹打混匀，室温放置5-8min，使红细胞完全裂解，将样品离心5-10min，弃上清液，将沉淀物在37℃培养基中重悬并计数；/n步骤三、原代培养：将取材得到细胞接种在DMEM培养基中，置于37℃、5％CO2培养箱内孵育40-60min，将未贴壁的细胞吸出，将样品离心5-10min，取下层沉淀，并接种于DMEM培养基中，如此反复3-4次，吸出未贴壁细胞，然后将悬液接种入已用大鼠IgG包被的培养皿中，置于37℃、5％CO2培养箱内孵育1-2h，收集未黏附游离细胞的混悬液，将样品离心5-10min，弃上清液，将细胞种植于细胞培养板中，每孔0.6-1ml，于37℃细胞培养箱中培养，24h后以原代细胞进行实验研究；/n步骤四、胺碘酮致纤维化肺细胞的培养：将胺碘酮加入无血清培养基DMEM配成胺碘酮终浓度为10-180umolg/L的培养基，向含有胺碘酮的培养基中加入终浓度为5-10μM的1-磷酸鞘氨醇，加入终浓度为1-5μM的激动剂SEW2871,加入终浓度为0.1-0.5μM的二氢辣椒碱,于4-6℃储存；将培养基更换为含有不同浓度的胺碘酮的新鲜培养基，将细胞培养板置于37℃细胞培养箱中进行培养；/n步骤五、检测：向上述培养板每孔中加入CCK8试剂，加完试剂后轻轻敲击培养板混匀CCK8检测液；将加入CCK8检测液的培养板再次置于37℃细胞培养箱中培养1-2小时；取出培养板，使用酶标仪在波长为450nm的条件下测定吸光度。/n