[发明专利]一种斜带石斑鱼CCR12的多克隆抗体制备方法及其应用

摘要

一种斜带石斑鱼CCR12的多克隆抗体制备方法及其应用。目前在鱼中发现了3种XCR1样趋化因子受体，即XCR1、XCR1L和CCR12，其中XCR1L和CCR12只在鱼类基因组中发现，但关于其功能研究甚少，截止目前，尚未有关于鱼类CCR12体外表达的任何报道，尚未有人制备过斜带石斑鱼的CCR12多克隆抗体，关于CCR12多克隆抗体的应用更无任何报道。为进一步揭示石斑鱼CCR12阳性细胞在寄生虫感染组织中的迁移或增殖情况，鉴定CCR12阳性细胞类型，本研究首次通过原核系统表达纯化了CCR12的N‑端区和3个胞外区重组蛋白，并最终首次制备了兔抗CCR12重组蛋白多克隆抗体，该抗体能特异性识别石斑鱼CCR12蛋白，且标记血液中的细胞，为我们今后标记CCR12阳性细胞并开展其抗寄生虫感染研究奠定基础。

主权项

一种斜带石斑鱼CCR12的多克隆抗体制备方法及其应用，其特征在于，步骤如下：(一)石斑鱼CCR12的原核表达及纯化：I、CCR12重组表达载体的构建(1)目的片段扩增；a.通过SMART软件分析，斜带石斑鱼CCR12是一种七次跨膜蛋白，由一个N‑端区、3个胞外区、3个胞内区和一个C‑端区构成；选择斜带石斑鱼CCR12的N‑端区和3个胞外区进行扩增；b.以CCR12NF/R、CCR12EL1F/R、CCR12EL2F/R和CCR12EL3F/R为引物，以前面合成的cDNA为模板，用高保真酶PrimeSTARTM Mix分别扩增CCR12的N‑端区和3个胞外区；c.再以CCR12NF/EL1R为引物，步骤b扩增的CCR12N‑端区和第1个胞外区为模板，通过重组PCR连接N‑端区和第1个胞外区；同时，以CCR12EL2F/EL3R为引物，以步骤b扩增的CCR12的第2和第3个胞外区为模板，通过重组PCR连接第2和第3个胞外区；d.最后，以CCR12NF/EL3R为引物，以步骤c连接成功的两个融合片段为模板，通过重组PCR将CCR12的N‑端区和3个胞外区连接到一起，胶回收目的片段。其中，引物CCR12N F的序列为CGGGATCCATGAGCGACGAATTTCTGCT，引物CCR12N R的序列为AGAACCACCGCCGCCAAATTTCGCACCAAAGTGG，扩增片段为41bp；引物CCR12EL1 F的序列为GGCGGCGGTGGTTCTCATCTGTCTGAATGG，引物CCR12EL1 R的序列为AGAACCACCGCCGCCGTAGGCACTGCTGAC，扩增片段为87bp；引物CCR12EL2 F的序列为GGCGGCGGTGGTTCTAAAAATGTGGGTAGCA，引物CCR12EL2 R的序列为GCTGCCACCGCCACCGAATTGCTGGTAATA，扩增片段为135bp；引物CCR12EL3 F的序列为GGTGGCGGTGGCAGCGCTATTCAGATCTC，引物CCR12EL3 R的序列为CCGCTCGAGTCACGCATAGTCCAAGCTCT，扩增片段为96bp；引物序列中下划线部分表示酶切位点。(2)表达载体的提取；(3)双酶切目的片段和表达载体；(4)重组表达载体构建：通过菌落PCR法鉴定阳性克隆，并进行测序；II、CCR12重组蛋白表达条件的优化(1)CCR12重组蛋白的诱导表达；(2)重组蛋白表达条件的优化；a.IPTG浓度的优化；b.诱导时间的优化。III、CCR12重组蛋白的纯化；(二)斜带石斑鱼CCR12的多克隆抗体制备：I、CCR12多克隆抗体制备：(1)将两只新西兰雄兔在无菌动物房适应饲养2周；(2)取约2mg重组蛋白，加入PBS至2ml，加入2ml弗氏完全佐剂，反复推拉共轭注射器使重组蛋白乳化；(3)用无菌注射器吸取已与弗氏完全佐剂乳化的重组蛋白，对新西兰雄兔分多个位点进行皮下注射(注射位点需先用75％酒精棉消毒)，注射剂量为1ml/只；(4)两周后，进行加强免疫，以初始免疫一半重组蛋白量与等量的弗氏不完全佐剂乳化混匀后，对新西兰雄兔进行皮下注射，共加强免疫3次，每次间隔时间均为2周；(5)最后一次加强免疫7天后，对免疫新西兰雄兔进行颈动脉采血，室温静置2h，4℃过夜，4℃、4000r/min离心30min后小心吸取上层血清，56℃处理30min以灭活补体，用protein A柱子进行纯化，分装后‑20℃保存。II、ELISA测定多抗效价；III、Western blotting检测多抗的特异性：(1)提取斜带石斑鱼头肾的总蛋白和膜蛋白；(2)多抗的特异性检测：a.抗原蛋白SDS‑PAGE电泳后，将凝胶按照点样泳道切割成适当大小浸泡在转膜缓冲液中；b.将PVDF膜裁剪成与凝胶相匹配的大小，浸泡在转膜缓冲液中；c.按照黑板即负极、泡沫垫、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸、泡沫垫、白板即正极的顺序固定凝胶和PVDF膜，注意排除气泡；d.将装置放入转印槽中，加入转膜缓冲液，100V转膜23min；e.转膜结束后，取下PVDF膜，加入10％脱脂奶粉室温封闭1h；f.加入适当一抗(即制备的CCR12多克隆抗体)，4℃孵育过夜；g.弃去一抗，用PBST洗涤3次，每次5min；h.加入用10％脱脂奶粉稀释的二抗室温孵育1h；i.弃去二抗，用PBST洗涤3次，每次5min；j.用化学发光法进行显示拍照。