[发明专利]一种斜带石斑鱼CCR12的基因克隆和原核表达、纯化方法

摘要

目前在鱼中发现了3种XCR1样趋化因子受体，即XCR1、XCR1L和CCR12，其中XCR1L和CCR12只在鱼类基因组中发现，但关于其功能研究甚少，截止目前，尚未有关于鱼类CCR12体外表达的任何报道。为进一步揭示石斑鱼CCR12阳性细胞在寄生虫感染组织中的迁移或增殖情况，本研究首次构建了斜带石斑鱼CCR12的N‑端区和3个胞外区的重组表达载体，通过原核系统表达了CCR12的重组蛋白，为今后石斑鱼CCR12的体外研究奠定了基础。

主权项

一种斜带石斑鱼CCR12的基因克隆和原核表达、纯化方法，其特征在于，步骤如下：(一)石斑鱼CCR12基因克隆及序列分析：(1)石斑鱼组织总RNA的提取；(2)一链cDNA的合成；(3)CCR12序列的扩增；(4)目的片段的胶回收；(5)目的片段的克隆与转化；(6)序列分析。(二)石斑鱼CCR12的原核表达及纯化I、CCR12重组表达载体的构建(1)目的片段扩增a.通过SMART软件分析，斜带石斑鱼CCR12是一种七次跨膜蛋白，由一个N‑端区、3个胞外区、3个胞内区和一个C‑端区构成；选择斜带石斑鱼CCR12的N‑端区和3个胞外区进行扩增；b.以CCR12NF/R、CCR12EL1F/R、CCR12EL2F/R和CCR12EL3F/R为引物，以前面合成的cDNA为模板，用高保真酶PrimeSTARTM Mix分别扩增CCR12的N‑端区和3个胞外区；c.再以CCR12NF/EL1R为引物，步骤b扩增的CCR12N‑端区和第1个胞外区为模板，通过重组PCR连接N‑端区和第1个胞外区；同时，以CCR12EL2F/EL3R为引物，以步骤b扩增的CCR12的第2和第3个胞外区为模板，通过重组PCR连接第2和第3个胞外区；d.最后，以CCR12NF/EL3R为引物，以步骤c连接成功的两个融合片段为模板，通过重组PCR将CCR12的N‑端区和3个胞外区连接到一起，胶回收目的片段。其中，引物CCR12N F的序列为CGGGATCCATGAGCGACGAATTTCTGCT，引物CCR12N R的序列为AGAACCACCGCCGCCAAATTTCGCACCAAAGTGG，扩增片段为41bp；引物CCR12EL1 F的序列为GGCGGCGGTGGTTCTCATCTGTCTGAATGG，引物CCR12EL1 R的序列为AGAACCACCGCCGCCGTAGGCACTGCTGAC，扩增片段为87bp；引物CCR12EL2 F的序列为GGCGGCGGTGGTTCTAAAAATGTGGGTAGCA，引物CCR12EL2 R的序列为GCTGCCACCGCCACCGAATTGCTGGTAATA，扩增片段为135bp；引物CCR12EL3 F的序列为GGTGGCGGTGGCAGCGCTATTCAGATCTC，引物CCR12EL3 R的序列为CCGCTCGAGTCACGCATAGTCCAAGCTCT，扩增片段为96bp；引物序列中下划线部分表示酶切位点。(2)表达载体的提取；(3)双酶切目的片段和表达载体；(4)重组表达载体构建：通过菌落PCR法鉴定阳性克隆，并进行测序；II、CCR12重组蛋白表达条件的优化和可溶性分析(1)CCR12重组蛋白的诱导表达；a.将上一步骤测序正确的重组蛋白表达菌株接种到一新的含Amp LB液体培养液中，37℃、200r/min振荡培养过夜；b.将培养过夜的菌液按照1∶50比例接种到新鲜的LB培养液中，37℃、200r/min振荡培养至OD600为0.6‑0.8；c.添加IPTG至终浓度为1mM，30℃、200r/min振荡培养6h；d.取1ml菌液，室温4000r/min离心5min去掉上清后；e.以100μl双蒸水重悬，按照1∶4比例与5×SDS‑PAGE Loading Buffer混匀，水浴煮沸5min；f.将上述样品进行SDS‑PAGE凝胶电泳，检测CCR12重组蛋白是否表达，以pET32a的表达菌株的诱导组作为对照；(2)重组蛋白表达条件的优化；a.IPTG的浓度：将阳性克隆在37℃扩大培养至菌液的OD600达到0.6‑0.8时，加入0mM、0.1mM、0.3mM、0.5mM、0.7mM和0.9mM的IPTG在30℃诱导表达6h收集菌体，处理后上样跑电泳；b.诱导的时间：在最佳诱导浓度条件下，于诱导后的第0h、2h、4h和6h收集菌体，处理后上样跑电泳。(3)重组蛋白可溶性分析：SDS‑PAGE检测重组蛋白的可溶性；III、CCR12重组蛋白的纯化(1)将含重组表达载体的BL21菌扩大培养至1000ml，37℃、200r/min振荡培养至OD600为0.6‑0.8，添加IPTG至优化的最优终浓度，30℃、200r/min培养适当时间；(2)4℃、1000g离心1min收集全部菌体；(3)50ml 0.01mM PBS重悬菌体，4℃、1000g离心10min去上清；(4)50ml Lysis buffer重悬菌体，超声破碎，4℃、1000g离心10min收集上清；(5)通过Wash buffer和含不同浓度咪唑的Elution buffer依次对镍柱进行洗涤并收集流出液，用SDS‑PAGE检测洗脱效果；(6)纯化的蛋白液在PBS中透析过夜后，用超滤离心管进行浓缩，浓缩液‑80℃保存。