[发明专利]一种乳杆菌VBNC态的诱导方法

摘要

本发明涉及一种乳杆菌VBNC态的诱导及其检测方法，该方法包括乳杆菌的活化、乳杆菌VBNC态的诱导、乳杆菌VBNC态的检测、荧光显微镜检测样品前处理与荧光显微镜检测等步骤。本发明使干酪乳杆菌Zhang通过灭菌生理盐水4℃诱导成功获得了的该菌的VBNC态，保加利亚乳杆菌ND02在液体MRS中4℃诱导下进入VBNC态，且乳杆菌的VBNC态细胞表面出现褶皱，长度缩短，依旧保持完整细胞结构。所述的乳杆菌VBNC态仍具有一定的活性，并在适当条件下会恢复至可培养态，为提高乳杆菌在生产应用过程中活性的研究奠定基础。同时，本发明采用荧光染料(SYTO‑9和PI)与Leica DM4000B正置荧光显微镜的结合建立了一种采用载玻片而非滤膜的方便、快速检测细胞活性的方法。

主权项

1.一种乳杆菌VBNC态的诱导方法，其特征在于该方法的步骤如下：A.乳杆菌的活化将冷冻保存的乳杆菌接种于液体MRS培养基中，在温度37℃下进行活化培养，传代培养三代，得到活化乳杆菌，离心分离，收集的菌泥用灭菌生理盐水洗涤2～3次，然后重悬于灭菌生理盐水中，制成乳杆菌菌悬液；所述的乳杆菌是干酪乳杆菌Zhang；该乳杆菌的活化是在温度37℃下活化培养18～24小时；B.乳杆菌VBNC态的诱导将步骤A得到的乳杆菌菌悬液接入到灭菌生理盐水诱导液体中，使乳杆菌终浓度106～107CFU/mL，混匀，采用MRS琼脂培养基倾注培养法对诱导液中乳杆菌进行准确计数，平板计数结果为诱导液中初始活菌数，然后在4℃的温度下对诱导液中乳杆菌进行VBNC态诱导；C.乳杆菌VBNC态的检测步骤B的乳杆菌VBNC态诱导液充分震荡混匀，采用MRS琼脂培养基倾注培养，检测诱导过程中乳杆菌的可培养活菌数；D.荧光显微镜检测样品处理步骤B的乳杆菌VBNC态诱导液充分震荡混匀，再以10倍梯度将诱导液稀释至适宜浓度，离心收集菌泥，得到的菌泥用灭菌生理盐水洗涤2～3次，以除去它夹带的诱导液体，再采用荧光显微镜检测活性细胞数；E.荧光染料溶液配制将荧光染料SYTO‑9与荧光染料PI分别稀释在二甲基亚砜中，得到贮存浓度为50μM的SYTO‑9溶液与300μM的PI溶液，两种荧光染料溶液在低温下避光保存备用；F.乳杆菌荧光样品制备步骤D得到的洗涤菌泥用灭菌生理盐水制成20μL或50μL悬浮液，然后向该悬浮液中加入步骤E配制的荧光染料SYTO‑9与PI溶液，立即将菌液与荧光染料混匀后甩至管底，在室温与避光的条件下进行染色反应15min；吸取2μL染色完毕的菌悬液，滴在载玻片中心，然后加入2μL抗荧光淬灭封片剂混匀，盖上盖玻片，滴一滴无自发荧光的香柏油，在暗室中使用Leica DM4000B正置荧光显微镜，在激发波长450～490nm与发射波长515nm下观察并计数；G.荧光显微镜计数在荧光显微镜计数时，随机选择至少10个不同的视野，且每个视野内的荧光细胞数在30～300个之间，最后取平均值；在视野中观察到的呈现绿色荧光细胞被记为活性细胞，呈现红色荧光细胞则被记为死菌细胞；细胞的具体计数按照以下公式：式中：E为样品中乳杆菌活性细胞数，个/mL；S1为盖玻片面积，mm；S2为显微镜油镜视野面积，mm；V为样品稀释倍数；X为10个视野内平均细胞数，个。