[发明专利]乙型肝炎病毒前S1抗原的板式化学发光法检测试剂盒及制备方法有效
申请号: | 201710244167.6 | 申请日: | 2017-04-14 |
公开(公告)号: | CN107085111B | 公开(公告)日: | 2019-02-01 |
发明(设计)人: | 戴宝平;彭会军;徐亮;王剑 | 申请(专利权)人: | 江苏福隆生物技术有限公司 |
主分类号: | G01N33/576 | 分类号: | G01N33/576;G01N33/569;G01N33/535 |
代理公司: | 北京中济纬天专利代理有限公司 11429 | 代理人: | 赵海波 |
地址: | 214434 江苏省*** | 国省代码: | 江苏;32 |
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摘要: | 本发明涉及一种乙型肝炎病毒前S1抗原的板式化学发光法检测试剂盒,包括的试剂:生物素标记的乙肝病毒前S1抗体溶液、抗生物素抗体包被的酶标板、辣根过氧化物酶标记的乙肝病毒前S1抗体溶液、乙肝病毒前S1阴性对照、乙肝病毒前S1阳性对照、浓缩洗液、底物液A、底物液B。本发明的主要设计思路是在化学发光免疫分析基础上,通过引入具有抗生物素抗体‑生物素体系,稳定试剂盒检测特异性的同时,大幅增加了检测灵敏度以及检测时间。改进了高温振荡式抗生物素抗体包被工艺,从而降低抗体/抗原使用量的同时,简化了试剂生产流程,缩短了生产周期。 | ||
搜索关键词: | 乙型肝炎 病毒 s1 抗原 板式 化学 发光 检测 试剂盒 制备 方法 | ||
【主权项】:
1.一种乙型肝炎病毒前S1抗原的板式化学发光法检测试剂盒,其特征在于:包括的试剂:生物素标记的乙肝病毒前S1抗体溶液、抗生物素抗体包被的酶标板、辣根过氧化物酶标记的乙肝病毒前S1抗体溶液、乙肝病毒前S1阴性对照、乙肝病毒前S1阳性对照、浓缩洗液、底物液A、底物液B;该试剂盒的制备方法包括如下步骤一、浓缩洗液的配制,步骤如下:1、称取KCl 60g、NaCl 300g于1L 容器中;2、称取20.0g Tween‑20 于100ml 容器中加50ml 水使其完全溶解后,倒入上述1L 容器中;3、用移液器将Proclin‑300 量取2ml,倒入上述1L 容器中;4、用量筒量取适量纯化水于上述1L 容器中,充分搅拌直至完全溶解;5、调pH,控制其范围在7.35~7.45 之间;6、最后定容至1000ml,完全溶解后用0.2μm 滤器过滤即得;二、底物液的配制(一)底物液A 的配制步骤1、称取硼砂11.44g、硼酸4.948g、鲁米诺2.0g 和对碘苯酚0.2mg 于1L 烧杯中;2、用量筒量取纯化水于1L 烧杯中,充分搅拌直至完全溶解,调pH,控制其范围在7.95‑8.05 之间;3、用0.2μm 滤器过滤收集滤液,用纯化水定容至1000ml,混匀后即得;(二)底物液B 的配制1、称取硼砂11.44g、硼酸4.948g、过氧化脲0.2g 和PC300 500μl 于1L 烧杯中;2、用量筒量取纯化水于1L 烧杯中,充分搅拌直至完全溶解,调 pH 控制其范围在7.95‑8.05 之间;3、用0.2μm 滤器过滤收集滤液,用纯化水定容至1000ml,混匀后即得;三、对照品稀释液的配制,步骤如下:1、称取Tris 12.11g 和HCl 7 ml 于1L 的容器中,调节溶液pH, 控制其范围在7.35‑7.45 之间, 定容至1000ml ;2、用量筒量取小牛血清300ml,加入上述步骤1得到的溶液中,作为对照品稀释液备用;四、阴性对照、阳性对照的配制阴性对照的配制:取对照品稀释液,分装到适宜规格; 阳性对照的配制:按1:500~1:10000在对照品稀释液中加入乙肝病毒前S1阳性血清;五、抗生物素抗体包被的酶标板1配制0.01M的碳酸缓冲液,调节pH至pH9.6±0.1,备用;2在上述0.01M的碳酸缓冲液中加入抗生物素抗体溶液至终浓度为0.1~5μg/ml,搅拌30分钟至混合均匀;3将上述混合均匀后的溶液按包被量为100 μL每孔加入酶标板中,采用高温振荡式包被,包被温度为39±1℃,包被时间为1~3小时,采用低速振荡包被形式,选用的振荡仪为艾本森科学仪器有限公司微孔板振荡器,振荡幅度与方式:3mm,采用水平回转,转速为200~500rpm;4配制0.1M,pH7.4TBS缓冲液,含0.3wt%BSA,1wt%羊血清,0.1% Proclin300(v/v),1wt%鱼皮明胶,2wt%海藻糖和10wt%蔗糖,作为封闭液加入到清洗后的包被板中,封闭量为150μL每孔,封闭温度为37±1℃,封闭时间为2~5小时;5吸掉封闭液,放置在干燥箱中,干燥温度控制在37±1℃,干燥时间为2~4小时,再以铝箔袋真空包装,贴签备用;六、辣根过氧化物酶标记的乙肝病毒前S1抗体溶液的制备(一)酶反应物稀释液的配制1、取Tris 4.846g、HCl 2900μl 于烧杯中,然后在烧杯中加入纯化水,充分搅拌使试剂完全溶解;2、调pH,控制 pH 在 7.35‑7.45 ;3、称取BSA 4g 倒入上述烧杯中;4、最后烧杯定容至400ml,用0.2μm 滤器过滤即得;(二)辣根过氧化物酶 (HRP)与抗Pre‑S1抗体的偶联1、取乙肝病毒前S1抗体1mg 放置于1ml 玻璃管中;2、取200μl DMSO 溶解抗体使抗体的终浓度到达5mg/ml,然后充分混匀;3、按照1mol 抗体加入10mol 的辛二酸二琥珀酰亚胺酯的摩尔比例加辛二酸二琥珀酰亚胺酯到上述步骤2 得到的溶液中,37℃恒温箱中反应 1.5 小时;4、按照3mol 抗体加入1mol HRP的摩尔比往上述步骤3 得到的溶液中添加HRP,然后加入1ml 的pH 为7.4 浓度为0.1M 的PB 缓冲液,置于 37℃恒温箱中反应 3小时;5、将上述步骤4 配制的溶液用PD‑10 柱纯化,收集纯化液,按照1:3000 的体积添加自制的酶反应物稀释液,控制最终使用浓度在0.03‑5.0μg/ml,混合均匀即得酶反应物;七、生物素标记的乙肝病毒前S1抗体溶液的制备(一)生物素反应物稀释液的配制1、取Tris 4.846g、HCl 2847μl 于烧瓶中,然后在烧瓶中加入纯化水,充分搅拌使试剂完全溶解;2、调pH,控制 pH 在 7.35‑7.45 ;3、称取BSA 4g 倒入上述烧瓶中;4、最后烧瓶定容至400ml,用0.2μm 滤器过滤即得;(二)取生物素化抗体,以生物素反应物稀释液稀释,控制最终使用浓度在0.01~5.0μg/ml,混匀,即可得到生物素结合物。
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